高通量测序数据分析：RNA-seq

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本文围绕RNA-seq学习路线进行生信入门，主要内容有：

☆ RNA-seq方法原理

目的是要给mRNA测序，得到样本的基因表达信息。

• llumina的Truseq RNA建库方法：

☆ RNA-seq的生物信息分析

一、深度测序数据获取

和EBI、DDBJ组成INSDC，数据内容相同所以找NCBI就行。

（一）NCBI常用数据库

（二）测序数据的下载和处理：SRA Toolkit

1. 测序数据序列格式
   （1）FASTA：表示生物序列的文本格式，基因组和EST序列常常采用
   
   （2）FASTQ格式：表示生物序列及其质量的文本格式
   
   （3）ncbi SRA (Sequence Read Archive) ：存储高通量测序原始数据和比对信息，把FASTQ格式文件压缩为SRA格式
   
   绝大多数分析工具不支持SRA，需要使用配套工具包SRA Toolkit先行处理
   
   
   
   
   
   
   

1. SRA toolkit软件下载

在官网选择适合自己的版本下载。

#我选的ubuntu版本，其他一样，把下载链接修改一下就好了 wget http://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/2.10.5/sratoolkit.2.10.5-ubuntu64.tar.gz 

用conda install sra-tools失败，只好用wget方法或者手动下载到linux盘符下。把安装包下载后用tar xzvf 解压，再配置完PATH就安装好了。
检查配置：

prefetch -V 

2.用SRAtoolkit下载并处理NCBI数据

prefetch SRRxxxxxxx -O . #-O . 指定到当前路径，否则默认路径难找 

一个数据下了好久，大概1个多小时。不知道怎么优化。

（2）解压

fastq-dump SRRxxxxxxx.sra #解压后从sra文件变为fastq文件 

双端测序数据要加–split-files，否则解压后两端的数据不会分开，难以被其他软件读取 如果所用分析软件支持读取gzip，建议加上–gzip，将解压后的数据用gzip压缩，避免占用过多空间

fastq-dump --split-files --gzip xxx.sra 

（三）测序数据质控与过滤： fastp

默认报告文件名 fastp.json 和 fastp.html，处理多个样本时极易互相覆盖，建议改为样本名称

fastp参数设置

 # I/O options 输入输出序列文件 -i <单端-输入文件名> -o <单端-输出文件名> -I <双端-输入文件名> -O <双端-输出文件名> #过滤后的最短序列长度 -l 36 #默认15，建议设为36或40 # reporting options 报告参数 -j <the json format report file name > -h <the html format report file name > -R "report_title" 

二、序列比对：HISAT2

• 注释格式介绍
  （1）GFF/GTF格式：一般用于基因组和基因注释
  （2）