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非传统有益菌用于人用活菌药物的可行性
iMeta主页：http://www.imeta.science
综 述
● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.202
● 2024年5月26日，北京医院季福绥、金鹏飞团队联合万泽微生物研究院陈章然团队在iMeta在线联合发表了题为 “The feasibility of using pathobiome strains as live biotherapeutic products for human use” 的文章。
● 本研究论述了非传统有益菌用于人用活菌药物的可行性，评估了这些微生物的临床致病性和潜在益处，以及它们是否可以转化为活菌药物以发挥积极作用。
● 第一作者：金鹏飞、林雄
● 通讯作者：陈章然()、季福绥()
● 合作作者：徐文峰、李康宁、赵消消、郭思瑞、赵紫楠、蒋鲁杰、廖峰、常龙刚、汪敏、刘彦民、黄少磊
● 主要单位：北京医院药学部，国家老年医学中心，中国医学科学院老年医学研究院，北京市药物临床风险与个体化应用评价重点实验室（北京医院）；深圳市万泽微生物研究有限公司；北京医院心内科，国家老年医学中心，中国医学科学院老年医学研究院
亮 点
● 对于菌的科学评价应在菌株水平上进行，尤其是功能基因的鉴定，同时需要考虑生态位和药物相互作用的影响；
● 基于非传统有益菌菌株的活菌药物的开发，在安全性、有效性和质量管理具有特殊性；
● 重组活菌药物和活性代谢物是值得期待的开发形式。
视频解读
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全文解读
引 言
随着研究者对肠道菌群在人体健康中的作用特点及机制的不断阐述，人们已经意识到肠道菌群不仅与胃肠道健康相关，还与人体其他器官疾病密切相关。除了广为人知的双歧杆菌和乳酸杆菌等传统有益菌种，肠杆菌、拟杆菌和肠球菌等非传统有益菌也发挥着重要作用。部分学者也将一些与临床相关的非传统有益菌称为病理微生物。这个术语源自人类微生物组学研究。人们认为病理微生物可能通过与宿主相互作用而损害宿主的健康状态。如何评估这些微生物的临床致病性和潜在益处？它们是否可以转化为活菌药物以发挥积极作用？
非传统有益菌对人类健康有害还是有益？
首先，回答这个问题需要认识到同一细菌种类的不同菌株之间普遍存在个体差异。即使通过构建特定菌种的泛基因组来评估其性质，也难以准确划分菌种的好坏。例如，致病性大肠杆菌可以引发多种疾病，如败血症和脑膜炎，而以大肠杆菌为核心的合成菌群可以通过营养竞争有效地抵抗肺炎克雷伯菌的定植。其中，大肠杆菌Nissle 1917被广泛用作工程底盘细菌和药物传递载体，用于探索各种人类疾病的治疗方法。脆弱拟杆菌分为产肠毒素脆弱拟杆菌菌株（ETBF）和不产毒脆弱拟杆菌菌株（NTBF）。ETBF通常被认为是一种机会性病原体，而NTBF可能具有有益效果。因此，科学评价应该基于菌株水平而不是种水平。
进一步的，菌株之间的差异主要源于基因组内的特定功能基因，产生不同的代谢物和细胞结构差异，如细菌毒素、酶、细胞外多糖、脂蛋白和蛋白质糖基化。这些功能基因的存在与否决定了菌株是否具有影响人类健康的潜力。例如，携带致病基因cagA和vacA的幽门螺杆菌菌株被认为是高度致病的。同样，只有能够表达毒素如大肠毒素、肠毒素或溶血素的大肠杆菌菌株才可能表现出临床致病性。此外，同一细菌种类可能携带既有益又有害的功能基因。例如，粪肠球菌和屎肠球菌或携带帮助清除多种人类病原体的细菌素基因，以增强它们的生态竞争力，也可能携带epx基因，表达一种穿孔毒素，是目前在人类细胞中毒性最强的细菌穿孔毒素。类似地，这种复杂性也存在于脆弱拟杆菌中。毒素基因bft是脆弱拟杆菌中典型的有害基因。该基因编码一种锌依赖性金属蛋白酶，会通过切割结肠细胞基底侧表面的E-钙粘蛋白来破坏肠上皮屏障。另一方面，荚膜多糖A作为脆弱拟杆菌主要的功能分子，是发挥有益效果的关键要素。大量研究表明荚膜多糖A具有减少脓肿、预防结肠炎和减少细菌感染的潜力。然而，需要注意的是，同一基因可能表现出既有益又有害的效果。不同的研究发现，荚膜多糖A既可以激活CD4+ T细胞分泌IL-10来抑制炎症，又可以诱导分泌IFN-γ、TNF-α、IL-6和CXCL10，从而促进炎症。因此，评估特定菌株的优劣需要注意菌株内的功能基因及其调控机制。
其次，必须考虑生态位环境对菌株特定功能基因表达的调控，特别是对共生微生物区系的干扰，这可能导致菌株在不同生态位中的基因表达模式不同，从而发挥有利有弊的双重作用。例如，感染粪肠球菌OG1RF会增加线虫宿主的死亡率；然而，当与高致病性金黄色葡萄球菌共同感染宿主时，粪肠球菌OG1RF可以增加其自身活性氧物质的分泌，抑制金黄色葡萄球菌的生长，耗尽金黄色葡萄球菌分泌的铁载体，从而减少对线虫宿主的毒性。类似地，研究发现，仅感染单一粪肠球菌的IL-10缺陷小鼠会出现慢性结肠炎。然而，在多菌种合成菌群存在的情况下，粪肠球菌的转录组谱会发生改变，通过乙醇胺代谢途径抵抗结肠炎的发生。此外，粪肠球菌可以通过代谢调节精氨酸和鸟氨酸水平，重塑环境并增强艰难梭菌的毒力。因此，评估菌株的优劣也取决于菌株所处的生态位，以及对其他菌株的影响。
最后，细菌与药物之间的相互作用也是需要考虑的因素，因为肠道微生物群可以影响药物的疗效、毒性和生物利用度。体外实验分析了25种肠道细菌对15种药物的代谢影响，发现了29种新的相互作用关系。某些细菌可以通过代谢酶与度洛西汀结合来内部积累药物，从而降低线虫宿主体内药物的生物利用度。细菌分泌的酪氨酸脱羧酶可以将左旋多巴代谢为多巴胺，影响帕金森药物的疗效。
总之，科学评估应该基于菌株水平，关注菌株内的功能基因以及特定生态位中的代谢和基因表达调控模式。同时，考虑药物代谢问题对于准确评估其对人类健康的影响也非常重要（见图1）。
图1. 评估非传统有益菌菌株好坏的四个角度
首先应当基于菌株水平。第二，筛选并鉴定功能基因。第三，在适当的生态位下进行评估。第四，考虑菌株与药物相互作用的影响。
利用非传统有益菌开发活菌药物的主要挑战
目前活菌药物种类相对较少，其适应症范围主要集中于胃肠道疾病。事实上，对活菌药物的开发利用已经具有相当悠久的历史，并且相关的细菌发酵工业技术和设备也已经相对完善。然而，随着时间的推移，药物注册申报的要求不断提高，对药物的安全性、有效性和质量管理也提出了更高的标准（图2）。而由于活菌药物的主要有效成分是活的细菌，因此在活菌药物的开发过程中存在着一定的复杂性和特殊性，尤其是对于非传统有益菌而言。
最主要的障碍是对于安全性的担忧。首先，临床上常见由病理微生物易位而引起细菌感染，尤其是几种常见的病原菌，金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和屎肠球菌等，在血液、手术部位、尿道和其它身体部位引发感染。甚至有临床案例报道五例早产婴儿感染的肠球菌与医院服用的益生菌药物中的肠球菌同源。即使是乳酸杆菌，在免疫严重缺陷患者中也可能引起细菌感染。其次，细菌基因组中抗生素耐药基因和产毒毒力基因的存在和转移也存在安全隐患。虽然目前体内细菌间的抗生素耐药基因的水平转移仍是科学推论，但已有许多体外实验证明甚至不同种属的细菌间可以发生基因的水平转移.如在医院废水中发现，含碳青霉烯类耐药基因blaNDM-5的pX3_NDM-5质粒可从大肠杆菌传播至16种不同门的细菌。事实上，抗生素耐药基因在细菌中广泛存在。具有一定抗生素耐药的菌株或可与抗生素联合用药，以提高疗效或减少副作用，因此部分抗生素耐药性菌株也具有成药潜力。需要警惕的是对挽救性治疗用抗生素具有耐药性，且具有基因水平转移能力的细菌。对于产毒基因而言同样如此，真正需要警惕的是可在体内表达并直接造成人体损伤的产毒基因，而不是所有的毒力基因。一些与细胞粘附、定植和生物膜形成相关的某些毒力因素与目标菌株的生态位竞争力相关，是目标菌株发挥有益功效的组成部分。此外，微生物组测序发现健康人体和患者肠道菌群存在显著差异，表明特定菌种/菌属与临床疾病相关，虽然其中的因果关系不明，但暗示可能存在新的致病因子。第三种对于安全性的担忧是目的菌株或许影响药物代谢，导致增加药物毒性或产生副作用。正如上一节所提及的例子。当然，肠道细菌也可能在药物代谢过程中发挥有益作用。例如，阴道乳杆菌分泌β-半乳糖苷酶，可从日常饮食中酶解释放异黄酮黄豆苷元，从而减轻对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝毒性。然而，迄今为止，对细菌与药物相互作用的研究仍相对较少。
第二个挑战是复杂的药效研究。活菌具有自我复制的能力，且代谢产物的生成是动态的。目前认为活菌药物的作用机制主要包括通过生态位竞争调节肠道菌群，并产生一定浓度的有益代谢产物而发挥作用。因此，活菌药物的药效与其数量和代谢强度相关。然而，细菌的代谢强度受到生态位环境的影响，如宿主免疫低下、胃肠道损伤、pH变化和菌群互作。此外，细菌代谢产物种类多样，或存在多个有效靶点，使其有效性的研究更加复杂。另外，尽管目前活菌疗法的开发以单一菌株为主，但也有观点认为，多菌株配方可能更适合应对复杂的微生态环境，从而产生更显著的菌落扰动。然而，多菌株配方的开发需要进一步探究所包含的菌株、剂量以及配方菌株间的相互作用。这无疑增加了临床前研究和未来生产过程的复杂性。尽管如此，单一菌株和多菌株配方之间的选择仍然取决于它们对目标适应症的疗效。
第三个挑战是被忽视的产品质量管理。活菌药物在生产加工的过程中，例如搅拌、冻干和压片，以及货架期内随着存放时间的增加，不可避免会导致产品中活菌比例逐渐减小，而死菌比例逐渐增加。然而现有的质量管理通常只关注活菌数量，而忽视了死菌的影响。死菌也可能仍具有活性，或产生副作用，尤其是细菌裂解释放的脂多糖等内毒素。对于死菌的有效性和安全性研究不充分，可能成为活菌药物开发的阻碍。
图2. 利用非传统有益菌菌株开发为活菌药物的主要障碍
利用非传统有益菌菌株开发活菌药物需考虑安全性、有效性和质量管理。因其作为活性个体，具有一定的特殊性和复杂性。
未来可能的研究方向和应用途径
在此，我们提出了未来可能的研究方向和应用途径。首先，无论是对候选成药菌株的安全性和有效性的评估，都需要进行更多的基因功能研究，以揭示新的功能基因、致病因子和调控机制。这将允许我们通过多组学，如全基因组、蛋白质组和代谢组相结合的方式，通过生信分析的方式初步探究菌株的功能与安全性。其次，需要关注生态位环境和共生菌群对候选菌株基因表达的影响。这需要建立允许与菌群共存的体外器官模型或者动物模型，以进一步探究特定菌株的基因表达情况和有效代谢产物浓度是否足够影响人体健康，从而评估菌株的成药潜力。通过理论支持的方式降低药物开发的风险。最后，由于目前的研究背景仍不充分，出于谨慎考虑，即使是无毒菌株，也应在临床前研究中，关注菌株在特定疾病动物模型中的致病性，并在临床试验中关注细菌在免疫缺陷患者体内的易位和水平基因转移。
对于活菌药物的适应症而言，除了胃肠道疾病外，还可考虑皮肤病、阴道疾病、精神类疾病以及代谢性疾病等方向。然而，更值得关注的是，活菌药物的适用范围可不限于疾病的治疗或缓解，更值得期待的应用场景是降低药物毒性和副作用，以及在疾病预防方面的作用。例如，罗伊氏乳杆菌代谢色氨酸产生的吲哚-3-丙酸，可以提高anti-PD1抗体的免疫治疗效果，从而减缓小鼠的肿瘤生长速度。同样，将β-内酰胺酶基因引入乳酸乳球菌可以降低结肠的阿莫西林水平以保护肠道菌群，防止因抗生素治疗后引发的艰难梭菌感染。
在开发方法方面，目前广泛采用的策略是通过大规模筛选获取无毒性且具有潜在药用价值的菌株。而基因编辑技术或是可行的方法，通过敲入有益功能基因和敲除有害功能基因来平衡细菌的安全性和疗效，例如去除毒素基因或引入肿瘤抑制基因。事实上，目前基因工程活菌药物的科学研究已有不少，尤其在肿瘤治疗领域。基因改造后的减毒铜绿假单胞菌可通过低氧条件靶向肿瘤并释放外毒素杀伤肿瘤。EcN1917通过靶向肿瘤并释放L-精氨酸，同时联合抗PD-L1，可显著抑制肿瘤生长。EcN1917也可作为药物载体，靶向肠道递送丁酸以减轻炎症。利用工程细菌作为药物载体原位合成治疗药物特别适用于具有强细胞毒性、半衰期短或结构相对复杂、难以用传统方法纯化的化合物。例如近期在表皮葡萄球菌中发现的一种新型的抗菌小分子epifadin，具有广谱抗性和极短的半衰期，对金黄色葡萄球菌具有极强的杀菌作用，而对人体正常细胞活力的影响很小。
此外，一些生物技术公司正在开发重组活菌药物，涉及各种实体肿瘤、糖尿病足溃疡、银屑病、罕见的皮肤病内瑟顿综合征和苯丙酮尿症等适应症。癌症治疗和皮肤病相关的适应症是目前主要的关注领域。他们大多数处于临床前探索阶段，也有一些已进入临床后期。然而，即使有些备受期待的明星公司已经投入临床试验，但因三期临床未能达到预期终点而被迫停止进一步开发。临床试验伦理审查的通过给予研究者极大的鼓励。但不可否认的是，基因工程活菌从科学研究成功到商业成功之间依然长路漫漫。基因工程活菌药物的应用面临着公众认可度低、政策仍未完全放开，以及安全性有待进一步检验的问题，包括基因改造脱靶导致的潜在影响、如何避免特定菌株的逃逸、如何控制特定基因的扩散等。
除此之外，细菌活性代谢物也是一种可能的选择，通过细菌发酵提取难以化学合成的大分子活性成分，例如胞外多糖等细胞结构，甚至是灭活形式的菌体，如后生元。最知名的例子之一应该是巴氏灭菌后的嗜黏蛋白阿克曼菌。其外膜上的特异性蛋白Amuc_1100在70℃巴氏灭菌后仍有活性，具有减少小鼠脂肪量发展、胰岛素抵抗和血脂异常的能力，且在初步人类数据中显示对肥胖个体具有安全性，无不良反应，具有改善肥胖等相关疾病的潜力。当然，这类活性代谢物不属于活菌药物的范畴，更符合现代药物的开发理念，更直接、有针对性且剂量可控。
总 结
总之，将非传统有益菌，甚至是病理微生物菌株，简单地归类为有益或有害或许是不恰当的。针对每一株菌株，都需要进行广泛的基因功能和代谢途径的研究，包括菌群间、菌株与宿主间错综复杂的相互作用。对菌株遗传背景的充分认知是将其转化为人用活菌药物的必要基础。这种转化可以通过多种方法促成，包括大规模的菌株筛选、基因编辑修饰，或有效代谢产物的提取。尽管这些研究可能会非常漫长，且具有挑战性，但值得进一步探索。
引文格式：
Pengfei Jin, Xiong Lin, Wenfeng Xu, Kangning Li, Xiaoxiao Zhao, Sirui Guo, Zinan Zhao, Lujie Jiang, Feng Liao, Longgang Chang, Min Wang, Yanmin Liu, Shaolei Huang, Zhangran Chen, Fusui Ji. 2024. “The feasibility of using pathobiome strains as live biotherapeutic products for human use” iMeta 3, e202. https://doi.org/10.1002/imt2.202
作者简介
金鹏飞（第一作者）
● 主任药师，教授，博士生导师，北京医院药学部主任。
● 国家药典委员会委员，中国医药教育协会老年药学专委会主任委员。《临床药物治疗杂志》副主编，《中华老年医学杂志》等11个核心期刊常务编委或编委。第一作者/通讯作者发表学术论文200多篇（SCI论文30多篇），主持国家自然科学基金等课题12项。
林雄（第一作者）
● 万泽微生物研究院研发工程师，硕士毕业于广西大学生物学专业。
● 从事活菌药物领域的药品研发相关工作。共发表SCI论文4篇，专利1篇。
陈章然（通讯作者）
● 万泽微生物研究院研发总监，美国密歇根州立大学联合培养博士。
● 主要从事微生物组学研究及微生态活菌药物开发工作。已发表SCI论文近50篇，H-index为24，主持和参与国家自然科学基金等10余项，已申请专利30余项。
季福绥（通讯作者）
● 北京医院院长，主任医师，教授，博士生导师，全国人大代表。
● 科技部国家重点研发计划项目首席专家。北京医学会心血管内科分会候任主任委员，中国老年学和老年医学学会心血管病分会常务委员，中华医学会心血管病学分会委员、老年学组组长，中国医师协会心血管委员会委员。主要从事老年心脏病学的研究和冠心病的介入诊断及治疗，近年来致力于药物球囊在冠心病中的应用。主编国内第一部《药物涂层球囊在心血管疾病中的应用》，副主编《心脏病药物治疗学》。
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2卷4期封底
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期刊简介
“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百位华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表原创研究、方法和综述以促进宏基因组学、微生物组和生物信息学发展。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！目前期刊已经被ESCI、Scopus等数据库收录。
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