铜绿假单胞菌耐药机制及中药干预策略研究进展

大家好，欢迎来到IT知识分享网。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）隶属于革兰阴性假单胞菌属，是医院常见的机会致病菌之一，分布广泛且可引起多种感染[1]，相较于其他细菌序列，PA的基因组较大，编码了大量与有机物代谢、转运、外排相关的调节酶[2]。作为主要的机会致病菌，PA所致医院感染是重症监护病房的主要问题之一，具有较高的发病率和死亡率，PA通过固有性、获得性、适应性耐药机制对多种抗生素耐药[3]，且能逃避宿主免疫系统的杀伤作用，致使PA极难根除，目前被世界卫生组织列为关键菌株，成为重点关注对象[4]。尽管不断研制新型抗生素以对抗顽固的耐药现象，仍有菌株快速演化出耐药性并巧妙地避开抗生素捕获[3,5]。

中药具有作用靶点多、抑菌谱广、不良反应小、不易产生耐药性的特点，由于中医药独特的性质和治疗方案，很少有菌种对其产生耐药性[6]，且整合医学的提出促进了中西药的联合使用[7-8]。针对以上现状，本文对PA的流行病学及危险因素、耐药机制、中药干预耐药PA的相关策略进行总结，以期为PA的基础研究及临床用药提供参考。

1 流行病学及危险因素

PA与危及生命的一系列急慢性感染密切相关，包括囊性纤维化、呼吸机相关性肺炎、尿路感染、外耳炎、烧伤和创面损伤、骨和关节感染、菌血症和全身感染[5]。考虑到PA对医院感染的影响和对抗菌药物的“逃避”能力，PA被列为6种以抗生素耐药著称的ESKAPE菌株之一[9]。自2014—2022年，PA在中国的临床分离率趋势相对稳定，均处于革兰阴性菌中第3位[10]，由于PA对一些抗生素的高水平耐药，多药耐药及广泛耐药PA对全球医院感染的威胁日益增加[10-11]。

据2016年欧洲疾病预防控制中心关于ICU获得性医疗系统相关感染的流行病学报告，PA是ICU获得性肺炎、获得性尿路感染和获得性血液感染最常见的分离微生物[12]。近5年，PA对头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、环丙沙星、阿米卡星等抗生素的耐药率均有不同程度的下降（中国细菌耐药监测网数据），但全国血流感染细菌耐药监测联盟数据显示PA对哌拉西林-他唑巴坦、磷霉素、美罗培南的耐药率具不同程度的增加。故仍需保持对PA抗生素耐药性的警惕。

PA具有流行克隆种群结构，标记为特定序列类型（sequence types，ST），一些STs在世界范围内广泛传播，与疫情和碳青霉烯酶的传播密切相关，如ST235、ST111和ST175被指定为高风险克隆株[10]，与其他克隆株相比，高风险克隆株更易获得和/或维持抗生素耐药相关基因[5]。

2 PA基于群体感应（QS）和免疫逃逸的耐药机制

QS是一种细菌细胞间的通讯机制，它以种群密度依赖性的方式调控细菌基因的表达[3]，与细菌感染性疾病的发生、发展都密切相关，群体感应信号分子（QSSMs）可诱导细菌中依赖于细胞密度的特定基因的表达，从而使细菌在群落范围内表现出新的行为特征，如调控毒力因子分泌、芽孢形成或生物膜形成、细胞分化、运动性、胞外多糖形成等[13]；QS调节剂的使用也被认为是一种新的治疗微生物相关疾病的途径，可以大大减少微生物的毒性、生物膜生成及耐药性[14-15]。

QSSMs是一类脂溶性小分子，可穿透宿主细胞影响其功能，近年来，QSSMs对宿主细胞功能的直接影响也引起了广泛关注[13,16]。生物被膜下细菌的免疫逃逸可能是细菌逃避机体免疫系统的杀伤作用、使细菌能够长期存在并成为感染源的重要原因，亦是导致细菌生物被膜相关感染反复发作的又一重要原因[17]。故QS和免疫逃逸为PA对抗菌药物产生耐药性及引发机体严重感染的重要机制（图1）。

2.1 抗生素耐药机制

PA产生抗生素耐药主要取决于多种固有性和获得性抗生素耐药机制（图1-A），包括生物膜介导的耐药和多重耐药细菌的形成[2]。PA的获得性耐药机制主要与产生抗生素钝化酶、影响外排泵基因表达、影响外膜通透性、获得耐药基因或适应性耐药有关。

2.1.1 产生抗生素钝化酶

抗生素多具有酰胺键和酯键，易被PA产生的酶（如β-内酰胺酶和氨基糖苷修饰酶）水解，PA产生的超广谱β-内酰胺酶是抗生素抵抗的最主要机制[18]。

2.1.2 影响外排泵基因表达

细菌外排泵与细菌外膜协同作用，可选择性地将进入细菌内部的抗生素及外源生物物质排出，耐药结节细胞分化（RND）家族外排泵在PA抗生素抵抗中起重要作用，PA表达12种RND外排泵，其中4种可对抗生素产生可诱导的、不可遗传的耐药性[19]：内膜转运蛋白多药耐药蛋白-外膜蛋白（Opr）复合物MexAB-OprM负责β-内酰胺和喹诺酮类外排，MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM分别负责β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类外排[2]。外排泵参与调节QS、影响毒力因子表达、生物膜形成、细菌耐药基因突变及逆转等环节，抗生素通过低剂量、长时间作用于PA可刺激外排泵表达上调而产生高水平耐药[19]。

2.1.3 影响外膜通透性

大多数用于治疗PA感染的抗生素必须穿透细胞膜到达细胞内，鉴于外膜蛋白与胞外介质间的交流作用，孔蛋白在PA降低外膜通透性方面起重要作用，其可分为非特异性孔蛋白、特异性孔蛋白、门孔蛋白、外排孔蛋白4类[20]。非特异性孔蛋白OprF在PA中占主导地位，OprF通道多呈关闭状态，致使PA外膜通透性远低于其他细菌，且OprF的缺失增加了PA生物膜的形成[21]；特异性孔蛋白OprD参与抗生素摄取，其缺失增加PA对碳青霉烯类抗生素的耐药性；门孔蛋白OprH是PA的过表达导致外膜脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）修饰，增加对多黏菌素B和庆大霉素的耐药性[2]；外排孔蛋白可将药物泵出菌体外膜[20]；PA分泌的外膜囊泡可将多种毒力因子转运至宿主细胞质中，包括溶血性磷脂酶C、β-内酰胺酶等[18]。

2.1.4 获得耐药基因或适应性耐药

PA可通过水平基因转移获得或突变为耐药基因[2]，如特异性孔蛋白OprD及MexAB-OprM外排泵过表达，可导致抗生素摄取减少、抗生素靶点修饰、外排泵和抗生素钝化酶过表达，在PA耐药性的传播中发挥关键作用[2,20]。PA亦可通过影响基因/蛋白表达产生适应性耐药以增加抗生素抵抗[22]，形成生物膜是PA最主要的适应性耐药策略。

2.2 QSSMs的特征、QS系统及与宿主间的作用

革兰阴性菌能释放一系列的脂溶性小分子QSSMs于周围环境中，这些小分子也可自由进出细菌，通过扩散到达黏膜上皮或皮下组织及脉管系统[23]，多为N-乙酰基同型丝氨酸内酯（AHL）家族，AHL在QS系统中起重要作用，其介导的微生物间信号可以调节毒力因子产生、抗生素和胞外多糖的生物合成、细胞聚集、稳定生长等多种功能[13]。

PA的QS系统主要包含4种子系统：AHL合酶LasI/LasR型系统、RhlI/RhlR型系统、假单胞菌喹诺酮类信号（PQS）、组氨酸激酶GacS/GacA型系统[24-25]，均与AHLs具直接作用。PA可产生N-丁酰-L-高丝氨酸内酯（C4-HSL）和N-3-氧十二烷基-高丝氨酸内酯（3-oxo-C12-HSL）2种AHL，与QS系统联合调节鼠李糖脂、蛋白酶、毒力因子产生和生物膜的形成[13]。AHL可通过快速激活Caspases-3、7、8，使线粒体膜电位去极化，从线粒体释放细胞色素C至细胞质，致使细胞和细胞核收缩，最终引起气管上皮细胞凋亡[26]；AHL亦能强烈诱导巨噬细胞和中性粒细胞凋亡[27]。

2.3 毒力因子及与宿主间的作用

PA可释放出一系列的毒力因子感染机体并引起疾病，包括脂多糖、外膜蛋白（OMPs）、黏附素、分泌系统等[18]。这些毒力因子的调控均依赖于细胞密度，通过释放QS自诱导剂进行调节[28]。脂多糖中脂质A的内毒性可导致组织损伤、PA附着及宿主受体的识别，亦与抗生素抵抗和生物膜生成相关[29]；OMPs与能量交换、黏附、抗生素耐药相关；鞭毛及其他黏附素亦会引起抗生素耐药现象；分泌系统与宿主定殖、黏附、移动能力及QS信号密切相关；胞外多糖可促进生物膜生成，进而影响细菌清除[30]。

PA可通过分泌系统释放毒力因子以调节机体免疫反应，进而促进PA免疫逃逸及定殖[31]，研究表明Ⅲ型分泌系统（T3SS）及T6SS分泌系统与调节宿主-病原菌反应密切相关，包括宿主细胞凋亡、炎症反应、定植、运动、生物膜形成和细菌竞争/相互作用[32]。

2.4 QSSMs及QS对免疫反应的影响

PA可出现于任何环境中，免疫抑制人群更容易感染PA引发急慢性感染[18]。当病原菌及其代谢物入侵机体时，宿主可通过模式识别受体（如Toll样受体）激活免疫反应。适宜的免疫反应有助于抑制细菌侵袭，但过度炎症反应会进一步加剧疾病进程，引发组织损伤甚至死亡[13,18]。固有免疫是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线，由屏障结构、吞噬细胞（巨噬细胞和中性粒细胞）、自然杀伤细胞等细胞和补体、细胞因子3部分组成。

AHL对宿主固有免疫及适应性免疫系统均具较强的影响，可调节中性粒细胞的吞噬作用、抑制树突状细胞（DCs）抗原呈递，进而引起促炎因子释放并加剧气道炎症。巨噬细胞对AHL具较强的吞噬作用，AHL通过减弱巨噬细胞的免疫炎症反应以导致PA的慢性感染[33]；在AHL存在时，脂多糖刺激可抑制人DCs中促炎因子白细胞介素-12（IL-12）和γ-干扰素的分泌进而抑制免疫反应[34]；AHL可通过抑制丝裂原刺激和抗原刺激的T淋巴细胞的增殖和功能[35]，调节B淋巴细胞产生抗体[36]，并通过线粒体途径诱导Jurkat细胞凋亡，进而抑制DCs和T细胞的活化和增殖，下调DCs共刺激分子的表达[37]；AHL可通过抑制脂多糖诱导的核因子-κB（NF-κB）活化，从而引发淋巴细胞死亡[38]。

PA生物膜的胞外基质可极大削弱巨噬细胞的吞噬功能和活性氧生成能力，激活炎症小体并促进炎症因子IL-1β、IL-18的表达，其胞外基质藻酸盐可清除自由基，产生的鼠李糖脂可损伤中性粒细胞的吞噬功能，从而产生免疫逃逸；同时，活化的中性粒细胞可进一步促进黏液型PA的黏附、生物膜形成及胞外基质藻酸盐的产生，使其在机体内持续慢性感染，难以清除[39]。这些不被杀死的PA在生物膜内缓慢生长，并进一步产生耐药基因，待机体免疫力下降时，持留PA将重新感染机体，且产生更为严重的影响，对临床治疗带来困难[40]。

PA的耐药机制见表1。

3 中药干预耐药PA感染策略

传统中医药学对耐药菌所致感染性疾病并无确切定义，应归属于“外感、热病、伤寒、温病”领域。依据耐药菌感染的临床特点，当代医学归纳其病因病机基本为正虚邪实，痰、热、湿、瘀互结，致使疾病缠绵难愈[45]。中医药强调整体辨证、扶正祛邪以达到阴平阳秘[45]。通过分析河南中医药大学第一附属医院2018—2021年耐碳青霉烯PA（CRPA）感染患者的用药情况，发现临床抗生素联合使用的中药以清热解毒、清热燥湿、扶正祛邪类为主。黄晓辉等[46]研究发现，此类中药多具有抗菌活性较高、毒性低、不易产生耐药性等特点。针对PA的耐药机制，中药通过直接抑菌及杀菌作用、抑制QS、抑制生物膜、调节机体免疫等作用控制PA引发的感染[3]。

3.1 直接抑菌及杀菌作用

许多中药的单体成分、单味中药、中药复方及中成药对病原菌具有抑制生长或直接杀菌作用[47]：研究发现草果醇提物、三七、槟榔、热毒宁注射液、双黄连口服液和金振口服液对临床分离多耐药PA具良好抑菌作用[48-50]；三黄地榆散能有效抑制多耐药PA生长，且可显著下调大鼠血清白细胞及体内炎性因子水平[51]。

部分中药可增强抗生素对多耐药PA感染的抗菌作用或恢复已耐药PA对抗菌药物的敏感性[52]：黄连生物碱可增加临床分离多耐药PA对头孢吡肟、左氧氟沙星的敏感性[53]，黄连素与亚胺培南、美罗培南联用具良好协同抑菌效果，在一定程度上逆转CRPA的耐药性[54]；金银花水煎剂可在体外通过消除R质粒逆转产金属酶PA的耐药性，但逆转效率较低[55]；双黄连注射液与头孢他啶联用具有较好的协同或相加作用，可能通过抑制TEM型ESBLs耐药基因起作用[50]。

中药还可通过调节耐药菌外排作用调节细菌耐药性[56]，黄连素可降低Mex AB-OprM外排泵相关基因的相对表达量改善CRPA的耐药性[54]；痰热清可下调多耐药PA中4种外排泵相关基因mexAB、mexCD、mexEF、mexXY的表达量[57]；扶正解毒化瘀方水提物具较弱抑菌作用，可特异性抑制β-内酰胺酶恢复耐药PA对碳青霉烯类抗生素敏感性，但不能恢复对头孢类、喹诺酮类的敏感性，通过下调mexB、oprM基因表达、上调阻遏蛋白相关基因mexR的表达而抑制MexAB-OprM外排泵缓解耐药PA所致肺炎[58-59]。

3.2 抑制PA生物膜形成及QS

中药对PA生物膜具显著抑制作用，且可作为天然的QS抑制剂使用。高磊等[24]以PA QS系统相关重点蛋白BEL-1型蛋白、AmpC型蛋白、外排泵操纵子抑制因子、烯基还原酶、喹诺酮类生物合成酶为靶点，通过分子对接方式从五倍子、苎麻根、羊蹄甲、火炭母、叶下珠、水松、多花野牡丹中筛选到17个小分子配体，并通过体外实验发现以上7味中药对临床耐药PA菌株具直接抑菌作用。

鱼腥草素可通过显著抑制PA的鞭毛和菌毛结构基因flgB和pilG的表达抑制PA运动[60]，通过抑制LasI、LasR的表达减少QS调节毒性因子释放[61]，通过抑制生物膜关键调节蛋白BdlA的表达抑制其扩散，并可抑制炎症生成[3]；穿心莲内酯、黄芩苷、黄连素、绿原酸、金银花、连翘、败酱草水提物均可通过下调QS相关基因抑制Las、Rhl、PQS系统，显著降低PA生物膜聚集，减少细菌毒力因子释放，增加生物膜对抗生素的渗透性[3,62-65]；以扶正散邪为总治则的芪归银方可通过下调QS相关蛋白（PhzA、PhzB、PhzM、MetQ1）表达，缓解耐药PA所致肺炎并有效减弱其对亚胺培南的耐药性[66]；痰热清注射液可通过抑制上游GacS/GacA和PprA/PprB体系抑制下游Las、Rhl、PQS系统，进而降低QS所致毒性基因表达[67]。

3.3 抗炎及调节机体免疫

脂多糖是PA细胞壁的主要致病成分，通过与TLR4结合，促进NF-κB核转位和活化，进而促进炎症早期最主要的炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的过度释放，促进炎症发展，在炎症晚期通过高迁移率族蛋白（HMGB1）促进炎症反应[68]。免疫调节作用是中药的重要功能，可通过多种免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等）激活或抑制免疫反应[3]。

扶正透邪方在耐药PA感染早期可提高TNF-α水平以促进炎症反应消除病原菌，晚期可减少HMGB1释放以抑制炎症反应，维持机体免疫稳态[68]。芪归银方可通过调节HMGB1基因和蛋白水平表达、影响其受体糖基化终末产物受体（RAGE）和Toll样受体4（TLR4）水平进而调节机体免疫应答，缓解耐药PA所致肺炎[69]。扶正解毒化瘀方可通过调节TLR4信号通路所致炎症“瀑布效应”，进而促进炎症损伤修复及逆转PA耐药[70]。

痰热清可通过抑制炎性细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10）、激活氨基末端激酶（JNK）1/p38/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路改善急性PA肺部感染大鼠肺损伤的严重程度和炎性细胞浸润[71]。依“清透”立法组成的蒌芩止嗽优化方对机体免疫具双向调节作用，减轻机体炎症反应，提高机体免疫力[72]。临床研究表明清瘟解毒汤、通腑清肺汤、清金化痰汤通过降低炎症水平改善泛耐药PA所致重症肺炎[73-75]。血必净注射液通过抑制炎性因子释放，缓解早期过度的固有免疫反应和潜在的免疫抑制作用，减弱炎症与凝血过程交联作用，保护内皮细胞，维持器官的生理功能等作用以降低败血症患者死亡率及并发症发病率、改善预后、降低副作用[76]。

3.4 通过转运体及代谢酶介导药物相互作用

传统药物多与抗生素联合使用治疗感染性疾病，联合用药的药物间相互作用通过转运体、代谢酶等影响药物代谢及药效，炎症及免疫应答亦可调节药物代谢酶和转运体[76-77]。转运体在肝、肾、肠中分布广泛，根据底物跨膜运输方向不同，可分为摄取型转运体和外排型转运体[78]，部分抗生素通过摄取型转运体等进行吸收和分布，通过外排型转运体进行排泄，如喹诺酮类药物、利福平、β-内酰胺类抗生素均可通过有机阴离子转运多肽（OATPs）进入肝脏并通过肾脏转运体进行排泄[78-80]，大环内酯类及喹诺酮类可有效抑制外排型转运体P-糖蛋白（P-gp）[78]。

代谢酶细胞色素P450（CYP）酶系参与大量药物作用过程，环丙沙星、依诺沙星等均为其常见抑制剂[78]。目前对中药与抗生素联用后导致相互作用的报道较少，有研究表明黄芩苷通过诱导转运体相关蛋白OATP1B1的表达增加抗生素的肝脏摄取[81]，黄芩素可通过抑制代谢酶CYP1A、CYP3A4、P-gp介导的相互作用以增加环丙沙星肠道吸收并增强其抗菌作用[81]，热毒宁注射液能抑制CYP1A2活性[81]，黄连解毒汤可竞争性抑制P-gp和OAT/OCT的底物、并上调P-gp表达[81]；血必净治疗败血症时与抗生素具有良好药动学兼容性，血必净中大部分入血成分对代谢酶和转运体（CYP2C9/2C19/3A4、OAT1/3、OATP1B1/1B3）均不会产生抑制或诱导作用，但或可通过调节免疫炎症反应降低药物代谢酶及转运体的变化[76]。

中药干预耐药PA感染机制见表2。

4 结语与展望

PA是公认的医院内感染主要病原菌之一[72]，以耐药著称，临床治疗困难，QS与免疫逃逸为PA耐药性产生及感染难以清除的重要原因。目前针对耐药PA已有多种替代疗法处于体外及动物模型研究阶段，但极少能至临床研究阶段。具有独特理论体系的中药已有悠久的临床使用历史，且对急慢性感染具良好的预防和治疗作用。近年来，针对病原菌耐药机制，大量学者对中医药作用机制进行研究，发现中药单体成分、单味中药及中药复方可通过多种途径干预耐药PA所致感染，且中药与抗生素亦具有良好的协同作用。本文基于耐药PA的QS和免疫逃逸机制，系统综述其耐药机制及中医药干预策略，旨在为临床中西药合用治疗耐药PA所致感染提供参考，并为中药-机体、中药-病原菌及中药-抗生素间相互作用的进一步研究提供方向。

但目前中药干预PA耐药性研究仍存在以下问题：（1）多数中药研究目前仍停留在体外实验，对体内研究较少，且有效性及相关机制的临床研究较少；（2）中药属于多成分、多作用靶点、多作用途径的复杂体系，中药对抗细菌耐药性的机制尚不明确，且物质基础确证缺少直接证据，分子水平的基础研究相对较少，作用靶点仍旧模糊；（3）对于临床有效的中药复方，较难通过其组成药味的逐一研究阐释其组方合理性及临床辨证；（4）临床多采用中药-抗生素联合使用治疗感染性疾病，但对于中药与抗生素联用后导致的相互作用及中药对抗生素体内过程的影响等基础研究太少。

针对以上问题，可以耐药菌产生耐药的相关基因/蛋白为靶点，首先采用生物网络分析、大数据和人工智能等计算机方法选择有效中医方药[82]，预测中药成分的药理作用，并结合体外实验、动物模型、临床研究多维整合研究体系进一步验证以明晰中药及其复方干预细菌耐药的作用机制和生物学基础；形成“中药复方与中成药-中药药对-单味中药-中药组分及单体”的有效证据集，诠释干预PA耐药中药组分配伍的现代科学内涵；基于QS及免疫逃逸相关机制，系统性阐释细菌QSSMs对机体免疫反应的影响，以及机体通过对QS做出应答对细菌产生的影响；基于中药-抗生素相互作用，参照我国国家药品监督管理局发布的《药物相互作用研究技术知道准则（试行）》的相关规定，选择适当的研究方法，对潜在的药物相互作用进行评价，并依据评价结果科学制定临床合并用药策略及相应的剂量调整策略，以充分预防因中西药联用所导致的安全性风险。

来 源：吴娅丽，李伟霞，王晓艳，陈小菲，张明亮，张 辉，杨柳青，唐进法．基于群体感应和免疫逃逸的铜绿假单胞菌耐药机制及中药干预策略研究进展 [J]. 中草药, 2024, 55(14): 4991-5000.