蛋白质翻译后修饰（PTM）|甲基化研究策略

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在上一期PTM系列文章中，我们介绍了泛素化修饰的相关内容。本期带大家了解蛋白甲基化修饰的相关知识点，重点整理了蛋白质甲基化的机制、相关酶以及底物研究现状，供大家参考学习。

图1 蛋白质甲基化化的代表性功能[1]

蛋白质甲基化是指通过将甲基从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移至特定甲基受体而形成的蛋白修饰，通常发生于赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺的侧链，其中以赖氨酸和精氨酸的甲基化最为常见。与其他PTM类似，蛋白质甲基化也是一种可逆修饰。蛋白质甲基化修饰主要由生物酶介导，包括添加修饰的甲基转移酶和去除修饰的去甲基酶。

图3 蛋白质甲基化及去甲基化过程[2]

下面我们一起来了解一下最常见的两种氨基酸（赖氨酸和精氨酸）位点修饰相关酶类：

赖氨酸甲基化由蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMTs）介导，包含单甲基化（Kme1）、双甲基化（Kme2）和三甲基化（Kme3）三种形式，参与异染色质形成、X染色体失活以及转录沉默或激活等过程。PKMTs可分为两大类：

1、含SET结构域的甲基转移酶：大多数已知PKMTs属于此类，其催化活性依赖于保守的SET结构域。

2、不含SET结构域的甲基转移酶：此类多属于7-β链甲基转移酶家族，其标志性特征为扭曲的β折叠结构，可通过修饰蛋白质特定位点的赖氨酸残基影响染色质结构及基因调控表达。

根据催化反应类型的不同，赖氨酸去甲基酶主要分为两个家族：LSD和含Jumonji C（JmjC）结构域的去甲基酶。人类基因组编码有两种LSD酶（LSD1和LSD2）。LSD酶具有代谢酶中常见的胺氧化酶催化结构域和与染色质结合相关的swm结构域，该结构域稳定了蛋白质的整体结构。LSD1/2只能去甲基化单甲基化和二甲基化赖氨酸。而含有JmjC结构域的去甲基化酶则可催化单、双和三甲基化赖氨酸的去甲基化。到目前为止，在人类基因组中已鉴定出大约30种含JmjC结构域的蛋白质。

图2 蛋白甲基化类型[2]

精氨酸甲基化由蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）介导，包含三种类型：单甲基精氨酸（MMA）、不对称二甲基精氨酸（ADMA）和对称二甲基精氨酸（SDMA）。目前已鉴定出9种PRMTs：

I型精氨酸甲基转移酶：催化MMA和ADMA的形成，包括PRMT1、PRMT2、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8。

II型精氨酸甲基转移酶：催化MMA和SDMA的形成，包括PRMT5和PRMT9。

III型精氨酸甲基转移酶：仅催化MMA的形成，如PRMT7。

目前对于蛋白质精氨酸去甲基化酶的鉴定主要集中与组蛋白的相关研究上，针对非组蛋白酶的去甲基化酶鉴定相关内容相对较少。而组蛋白精氨酸去甲基化主要由两种酶完成：PAD4，通过催化甲基精氨酸转化为瓜氨酸并释放甲胺，调控组蛋白精氨酸残基的甲基化状态；JMJD6，一种依赖Fe和酮戊二酸的含JmjC结构域的组蛋白精氨酸去甲基酶，JMJD6可催化组蛋白的去甲基化，并通过羟基化将其转化为甲醛，影响单甲基化、对称二甲基化和不对称二甲基化精氨酸残基的去甲基化。

随着对非组蛋白甲基化兴趣的增长以及蛋白质组学技术（尤其是质谱技术）的进步，甲基化底物蛋白的列表正在迅速扩展。根据PhosphoSitePlus数据库的统计，目前已记录了974种人类蛋白质中的1,005个赖氨酸甲基化位点，以及896种人类蛋白质中的2,159个精氨酸甲基化位点，其中大多数是非组蛋白底物。大多数已报道的甲基化位点是通过质谱分析获得的，这些修饰的功能仍有待进一步研究。尽管如此，传统的生物化学、分子和细胞学方法已被用于鉴定和表征大量赖氨酸或精氨酸甲基化事件，由此构建的甲基转移酶-底物网络正逐步揭示蛋白质甲基化的广泛性及其生物学功能。

图4 甲基化底物网络[2]

从当前的PKMT-底物和PRMT-底物网络数据来看，少数甲基转移酶主导着这些网络，如PKMT-底物网络主要集中在SETD7和常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2（EHMT2，即G9a，H3K9甲基转移酶）：SETD7除了能单甲基化组蛋白H3K4外，还修饰至少30种非组蛋白，而G9a可单或双甲基化至少17种非组蛋白，包括其自身。而在PRMT-底物网络中，PRMT1和PRMT5是主要枢纽：PRMT1甲基化至少17种非组蛋白底物，PRMT5甲基化至少25种非组蛋白底物。在PKMT和PRMT网络中，非组蛋白底物的数量远超组蛋白底物，表明甲基化的作用远不止于修饰组蛋白。由甲基化调节的生物学功能的范围与底物的多样性和上述网络的复杂性成正比。这些功能包括但不限于染色质结构重塑；基因转录；DNA复制、合成和修复；蛋白质合成；RNA代谢；细胞周期进展；凋亡以及信号转导等。

图5 蛋白甲基化参与的细胞信号传导[2]

图5 蛋白甲基化参与的细胞信号传导[2]

对于蛋白甲基化修饰的研究思路与前面介绍的PTM研究策略基本相似，一般围绕酶（包括催化结构等）和底物（包括修饰类型和位点）展开，在生物分子方面主要构建用于调控酶表达量/活性的载体、催化关键位点的突变体，以及底物潜在修饰位点的突变体（由于两种氨基酸的甲基化修饰发生方式及参与酶类均不相同，通常在制备功能失活型突变体时，会把原来的赖氨酸K突变为精氨酸R，而把甲基化位点为精氨酸R则突变为赖氨酸K）等验证疾病中的甲基化修饰情况，研究对疾病表型的影响作用。汉恒生物可咨询甲基化研究方案并定制靶向特定组织及细胞的基因调控（突变、敲低/除以及过表达等）工具，包括慢病毒（Lentivirus, LV）、腺病毒（Adenovirus，AD）、腺相关病毒（Adeno-associated-virus,AAV）以及质粒等，如有需求，欢迎随时咨询。

参考文献：

[1] Zhong Q, Xiao X, Qiu Y, et al. Protein posttranslational modifications in health and diseases: Functions, regulatory mechanisms, and therapeutic implications. MedComm (2020). 2023;4(3):e261.

[2] Biggar KK, Li SS. Non-histone protein methylation as a regulator of cellular signalling and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015;16(1):5-17.

[3] Murn J, Shi Y. The winding path of protein methylation research: milestones and new frontiers. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18(8):517-527.

[4] Rodríguez-Paredes M, Lyko F. The importance of non-histone protein methylation in cancer therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(10):569-570.