ChIP-seq那些事——本文带您轻松了解

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作者：转化医学平台

1. 什么是ChIP-seq?

染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称为结合位点分析，是研究体内蛋白质和DNA互作的有力工具，通常用于转录因子结合位点、组蛋白特异性修饰位点、核小体定位及DNA甲基化的研究。

将ChIP与二代测序技术相结合就有了ChIP-seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白，转录因子等互作的DNA区段。

ChIP-seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集到的DNA片段进行高通量测序。研究人员获得数百万条序列后将对应到基因组上，从而获得全基因组内组蛋白修饰水平、转录因子结合位点的信息[1,2]。

2.ChIP-seq能运用于哪些方面研究？

ChIP-seq作为表观遗传学研究的关键技术, NGS技术和计算分析的进步使我们能够系统地了解表观基因组如何促进细胞信号识别[3]，发育[4]，谱系分类[5]及癌症[6]和其他疾病[7,8]。具体来说ChIP-seq可以用于以下研究中：

（1）用ChIP-seq研究组蛋白修饰情况，以剖析表观遗传特征的特征和生物学功能。

常用于ChIP-seq分析地五个核心组蛋白标记：

1. H3K4me1和H3K27ac是与增强子区域相关的；
2. H3K4me3是与启动子区域相关的；
3. H3K36me3是与基因body区地转录区域相关的；
4. H3K27me3是与多梳蛋白的抑制作用相关的；
5. H3K9me3是与异染色质的修饰相关的；

*H是指组蛋白位点，K是指赖氨酸位点，me是指甲基化修饰个数；ac是乙酰化修饰。

（2）利用ChIP-seq可用来研究转录因子结合位点,解析该转录因子作用通路信息；转录因子在器官发育过程中起着至关重要的作用，在全基因组水平将转录因子定位于靶基因DNA是认识转录调控网络的有效方法之一。ChIP-seq技术能够揭示转录因子的结合位点，可在体内分析特定启动子的分子调控机制。

（3）利用ChIP-seq技术可得到核小体定位图谱；核小体定位在转录调控，DNA复制和修复等多种细胞过程中其中重要作用。基因组上核小体的位置的确定涉及DNA，转录因子，组蛋白修饰酶和染色质重塑复合体之间的相互作用。

（4）利用ChIP-seq技术可研究DNA甲基化情况；DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

3.关于ChIP-seq有哪些数据库？

现阶段有多个公共数据库可用于下载组蛋白修饰的ChIP-seq数据：

近期发表的人内皮细胞表观基因组数据库，包含424种组蛋白修饰的ChIP-seq和RNA测序（RNA-seq）数据集，这些数据集是从人体的9种血管中获得的[13]。该数据库包括各种数据类型（例如reads，映射文件，bigwig文件和峰列表）,适合作为ChIP-seq分析教程数据。

4.关于ChIP-seq的经典文章

2016年Dana Farber癌症研究中心在Nature上发表了题为Active medulloblastoma enhancers reveal subgroup-specific cellular origins的文章。该文章中研究者使用了四个亚型的髓母细胞瘤样本共28个材料运用ChIP-seq进行了H3K4me3和H3K27ac研究。结果研究者鉴定到20,406个差异的活性增强子并对这些增强子进行增强子靶基因预测，同时进行GO、KEGG等功能分析，最终得出了细胞系样本与肿瘤样本之间表观遗传调控机制存在差异，而且髓母细胞瘤不同亚型间表观遗传机制也不相同的结论，该研究为阐明癌症发生机制提供新的研究思路[13]。

2013年Cell期刊发表一篇名为Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells的文章。研究人员以人类中胚层细胞、神经前体细胞、间质干细胞等为材料，结合MethylC-Seq、RNA-seq、ChIP-seq技术，发现在早期发育阶段表达活跃的启动子往往富含CG，而H3K27me3主要与基因沉默相关。相反地，在后期优先表达基因的启动子上通常缺乏CG，并且该阶段中DNA甲基化是抑制基因表达的主要方式。该文章最终得出了胚胎干细胞的早期和晚期具有不同的表观遗传调控机制的结论，该研究解析了哺乳动物的发育过程表观遗传调控机制，加深了人们对胚胎发育过程中表观遗传规律的认识[14]。

2014年Weizmann科学研究中心在science上发表题为Immunogenetics. Chromatin State Dynamics During Blood Formation的文章。研究的材料包括小鼠全血，从HSC造血祖细胞，到髓系、淋系、红系的所有亚细胞，研究结合了RNA-seq、ChIP-seq、ATAC-seq技术，鉴定了48415个增强子区域并对其在发育过程中的功能、特性进行描述，阐明了控制造血过程中染色质动态变化过程和相关的转录因子网络。该研究哺乳动物血液发育提供了染色质动态变化的综合模型[15]。

5.ChIP-seq的优势与劣势

优势：

1. 与上代技术ChIP芯片相比，ChIP-seq技术可实现单碱基对的分辨率，更少的假信号干扰，更好的覆盖范围和更大的动态范围；
2. 二代测序使得基因组覆盖不局限于阵列上的探针序列。重复基因组区域，如异染色质或微卫星序列，都可使用ChIP-seq进行有效分析。
3. ChIP-seq在样本数量方面需要更少的量。
4. ChIP-seq产生更精确的蛋白质结合位点列表和转录因子、增强子和序列基序的鉴定。也可分析染色质和组蛋白变体的核小体定位和翻译后修饰。

劣势：

1. ChIP-seq成本较高，ChIP芯片技术每个阵列的成本约为400-800美元，而ChIP-seq的成本为每通道1000-2000美元。
2. ChIP-seq在免疫沉淀中使用抗体，数据的质量很大程度上取决于抗体的质量。且不同供应商，不同批次之间差异较大。验证抗体质量过程费力且耗时。
3. ChIP-seq数据分析产生图谱中的峰需要与对照样品的相同基因座进行比较，以验证峰的显著性。

参考文献

[1] P.J. Park, ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology, Nat Rev Genet 10(10) (2009) 669-80.

[2] T.S. Furey, ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions, Nat Rev Genet 13(12) (2012) 840-52.

[3] J. Ernst, et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types, Nature 473(7345) (2011) 43-9.

[4] K. Yamaguchi, et al. Re-evaluating the Localization of Sperm-Retained Histones Revealed the Modification Dependent Accumulation in Specific Genome Regions, Cell Rep 23(13) (2018) 3920-3932.

[5] D. Lara-Astiaso, et al. Chromatin state dynamics during blood formation, Science 345(6199) (2014) 943-9.

[6] Z. Zhao, A. Shilatifard, Epigenetic modifications of histones in cancer, Genome Biol 20(1) (2019) 245.

[7] K.K. Farh, et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants, Nature 518(7539) (2015) 337-43.

[8] W. Sun, et al. Histone Acetylome-wide Association Study of Autism Spectrum Disorder, Cell 167(5) (2016) 1385-1397 e11.

[9] C.A. Davis, et al. The Encyclopedia of DNA elements (ENCODE): data portal update, Nucleic Acids Res 46(D1) (2018) D794-D801.

[10] C. Roadmap Epigenomics, et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes, Nature 518(7539) (2015) 317-30.

[11] D. Bujold, et al. The International Human Epigenome Consortium Data Portal, Cell Syst 3(5) (2016) 496-499 e2.

[12] R. Nakato, et al. Comprehensive epigenome characterization reveals diverse transcriptional regulation across human vascular endothelial cells, Epigenetics Chromatin 12(1) (2019) 77.

[13] Lin CY, Erkek S, Tong Y, et al. Active medulloblastoma enhancers reveal subgroup-specific cellular origins. Nature. 2016;530(7588):57–62.

[14] Xie W, Schultz MD, Lister R, et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 2013;153(5):1134–1148.

[15] Lara-Astiaso D, Weiner A, Lorenzo-Vivas E, et al. Immunogenetics. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 2014;345(6199):943–949.

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