工业废水处理厂中抗生素抗性基因（ARGs）和菌群的增殖和传播

大家好，欢迎来到IT知识分享网。

抗生素—人类身体的防御英雄，但越来越难以对抗有害细菌的恶作剧。原因何在？答案是：抗生素抗性基因的大规模传播，就好像这群微小的反派们突然间都闪闪发光，放大了威力，让我们的超级英雄们束手无策，目前全球公共卫生正面临巨大的挑战。

日化工业废水中富含二甲基甲酰胺 (DMF) – 这个与大部分有机液体和水都能混在一起的淘气鬼，一旦进入自然环境情况就会变得更糟。它就像一个无法控制的狂欢派对，会对我们的健康和环境造成严重影响，甚至还会对我们的肝脏和肾脏精心炮制一些损害。为了清除DMF，在污水处理过程中需要加入大量的降解微生物，这些微生物加入可能会影响ARGs的传播。

安徽师范大学的高轩课题研究组、安徽工业大学江用彬课题组和元哉生物公司研发团队合作。他们利用高通量QPCR技术和16S rRNA测序技术，瞄准了含有二甲基甲酰胺（DMF）的工业污水处理厂，以了解抗生素抗性基因（ARGs）的分布和传播。该成果已在PLOS ONE发表，文章题为：The proliferation of antibiotic resistance genes (ARGs) and microbial communities in industrial wastewater treatment plant treating N,N-dimethylformamide (DMF) by AAO process。科学家们希望在这场”治理豪赌”上，得到更多的人一同参与，一起找出战胜”淘气鬼”的有效方法！

论文摘要：

抗生素的过度使用导致抗生素抗性基因（ARGs）污染环境，对公众健康构成重大威胁。众所周知，污水处理厂（WWTP）是 ARGs 的储存库，被认为是细菌群落之间水平基因转移（HGT）的热点。然而，大多数研究都集中在ARGs在医院和城市污水处理厂中的分布和传播，而对其在工业污水处理厂中的命运知之甚少。在这项研究中，收集了工业污水处理厂中厌氧缺氧好氧（AAO） 过程的五个阶段的 15 个含有 N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的废水样品。研究结果显示，随着治疗的进展，DMF和化学需氧量（COD）含量逐渐降低。然而，生物处理废水中ARGs的数量和丰度增加。此外，DMF的残留物和处理过程改变了细菌群落的结构。相关性分析表明，细菌群落结构的转变可能是ARGs动态变化的主要驱动因素。有趣的是，观察到AAO过程可能作为微生物来源，并增加了ARGs的总丰度，而不是减弱了它。此外，发现非致病菌在废水中的ARGs丰度高于致病菌。该研究提供了对微生物群落结构的见解，以及驱动工业污水处理厂中ARGs丰度变化的机制。

图1：实验设计和结果展示

研究背景：

污水处理厂是一个富含微生物的环境，污水在物理沉降之后通常被输送到集水池，通过引入微生物的方式来经济高效地去除DMF、有机污染物和营养物质，从而保护水生环境。然而，因为WWTPs微生物密度高、多样性和活性高，以及抗生素耐药菌（ARB）和抗生素抗性基因的选择性转移潜力，人们担心WWTPs环境可能是ARB繁殖和ARGs传播的有利条件。以往的研究绝大多数集中于医疗污水处理厂和城市污水处理厂，我们对抗生素抗性基因在工业污水中的分布和传播知之甚少。通过对工业污水处理过程中不同阶段的多组重复样本进行生信分析，发现工业污水中ARGs种类和丰度特征及其影响因素，包括污水理化性质、微生物群落和处理工艺等，探究它们之间是否具有相关性，从而为更好的控制ARGs污染提供新的有效途径。

研究方法：

本团队研究的是中国安徽省马鞍山市一家工业废水的处理过程，该处理厂主要降解二甲基甲酰胺，通过在集水池（IN）、厌氧池（AP）、缺氧池（ANP）、好氧池（AEP）和二沉池（EF）等五个不同的处理过程进行采样，应用高通量QPCR和16S rRNA测序技术，试图确定厌氧-缺氧-好氧（AAO）处理过程如何改变原始污水成分的总体趋势，其次试图评估已鉴定的ARGs的关键信息，包括它们的类型和丰度，与移动遗传原件（MGEs）的关联，以及假定的细菌宿主的分类等。在整个研究过程中，5个处理不同的污水处理池被作为生物重复处理，以支持可靠和可推广的结论，通过测序获得的信息为了解经过AAO处理的含有二甲基甲酰胺的工业污水中ARGs和ARB的流动走向提供了可靠的方法。

研究结果：

研究发现从集水池到二沉池DMF含量从476.3mg/L下降到1.3mg/L，DMF的去除率为99.6%（图2A），COD含量从38049mg/L下降到79.5mg/L（图2B），COD含量和DMF含量变化一致，呈显著正相关（图2C），AAO过程在有效降解DMF的同时也降低了COD。IN处测得的16S rRNA拷贝数为8114，而EF处测得的拷贝数增加到42706，厌氧池、缺氧池、好氧池和二沉池期的16S rRNA丰度明显高于集水池（图2D），说明可能有很多细菌参与了DMF的降解过程。这些结果表明，为了有效去除DMF在AAO过程中引入大量微生物，细菌在这一过程中起着重要作用。

图2 污水处理过程中化学参数的变化。

A：DMF含量变化；B：COD含量变化；C：DMF与COD的相关性；D：16S rRNA拷贝数变化。

PCA图显示（图3A），厌氧、缺氧、好氧和二沉池的三个重复样本聚集在一起，表现出相似的特征，进一步的数据分析表明，在PCA轴上，集水池样本的ARGs分布与其他处理样本明显不同。这些结果表明，ARGs的丰度和多样性在集水池样品和处理之间发生了显著变化。此外，ANP、AEP和EF样品的重复样品呈聚类，而集水池的重复样品明显分离，说明入水口的ARGs变化不稳定，这可能是因为污水来源变化比较大，而经过AAO处理后ARGs的变化趋于稳定。从ARGs的绝对丰度图看（图3B），ARGs、MGEs的丰度有了显著提高，在AAO处理过程中多药（multidrug），转座酶（transposase）和磺胺类（sulfonamide）的丰度提高最多。说明含有这几类ARGs的细菌可能大量繁殖，成为优势菌。结合16S rRNA图，ARGs、MGEs和菌群的数据呈显著正相关，可能是因为ARGs的存在形式主要在宿主菌中。ARGs在厌氧环境中的相对丰度最高（图3C），在好氧时较低，说明菌群通常是厌氧菌群。这些厌氧菌群一般处于低氧或无氧的环境中生长，相对较少受到氧气的影响，而ARGs的传播通常与细菌细胞之间的基因交流和水平传递有关。因此，可以推测在厌氧环境中，由于较少受到氧气的影响，厌氧菌群更容易进行基因交流和水平传递，从而传播ARGs。这意味着在厌氧环境中的细菌菌群可能更容易发展出抗生素抗性，并传播给其他细菌。图3D是各个池子中所含有的ARGs，宽度表示所占的比例多少。ARGs的种类和数量在处理过程中发生了变化，如入水口主要由多重耐药类、转座酶类、氨基糖苷类构成，而出水口，主要由MGEs，多重耐药类和转座酶类构成。图3E为ARGs的主要抗性机制及其占比，ARGs的抗性机制构成在各处理中几乎没有发生变化，且以antibiotics deactived为主。

图3 污水处理过程中ARGs丰度的变化。

A：PCA分析；B：绝对丰度的变化；C：相对丰度的变化；D：样本与ARGs之间的弦图分析；E:抗性机制的变化。

维恩图表示了ARGs在污水处理过程中的分布（图4A）。IN、AP、ANP、AEP和EF样本之间的独特ARGs数量分别占各组ARGs总数的8%、0%、2%、3%和2%。IN中检测到8%（也就是10个）独特的ARGs，表明这些ARGs可以在AAO过程中被完全消除；IN和处理污水之间共有40%(也就是53个)抗生素抗性基因，这表明这些ARGs可能不会被AAO工艺消除。废水处理过程中将产生18个新的ARGs，这表明活性污泥可能是ARGs的储存库。如热图B和C所示，53个共享ARGs中丰度大多数都减少了，而18个新生成ARGs的丰度增加了。这些结果表明，AP、ANP和AEP污泥中的细菌是WWPTs中ARGs的主要来源，而不是IN中的废水。

图4 污水处理过程中ARGs的改变。

A：样本间的韦恩图分析；B：样本间共有的53个ARGs丰度变化；C：18个新生成的ARGs丰度变化。

菌群的PCA图（图5A）与ARGs的PCA图趋势相似，均显示样品按样品类型聚类，说明菌群可能是影响ARGs的主要驱动因素。结合16S rRNA基因拷贝图和ARGs丰度图，我们发现总ARGs丰度随着16S RNA拷贝数的增加而增加，因此细菌宿主繁殖引起的水平基因转移（HGT）和垂直基因转移可能是ARGs增殖的主要方式。各阶段均以变形菌门为优势菌群，随着DMF浓度显著下降，厚壁菌门的组成变化最大从35%下降到0.57%，而绿弯菌门的组成则从2.46%上升到11.44，拟杆菌门和酸杆菌门的组成分别从0.32%和0.42%逐渐增加到10.31%和3.81%（图5B），这些结果表明，厚壁菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和酸杆菌门中的一些细菌对DMF敏感。入水口的菌群多样性最低，随着AAO过程多样性升高，可能是引入的微生物为ARGs提供了更多的宿主菌群，同时有利于提高对DMF的降解能力，AAO过程改变了菌群的多样性和丰度。图5C显示在AAO处理过程中显著提高了酸杆菌门、芽单胞菌门的相对丰度，相反，一些门，如厚壁菌门、异常球菌门和蓝藻的丰度减少。图5D为13种病原菌的热图分布情况，一些病原体的丰度，如军团菌，在水处理后有所增加，然而大部分病原体的丰度在废水处理后明显降低。这些结果表明，在AAO过程中，耐药菌群向非致病性ARGs携带者转移。

图5 污水处理过程中细菌群落的变化。

A：PCA分析；B：不同样本间菌群结构；C：不同样本间细菌在门水平上的差异；D：不同样本间病原菌在种水平上的差异。

对53个共享ARGs与细菌组成之间进行了相关分析，如图6A所示，异常球菌门和厚壁菌门发现为各种ARGs和MGEs的主要潜在宿主，oprJ的潜在宿主细菌为酸杆菌。ARGs与细菌之间存在很大的相关性，主要为变形菌门、放线菌门。总体而言，厚壁菌门、异常球菌门、酸杆菌门、放线菌门和变形菌门在整个ARGs谱中具有最强的相关性，结果表明，这5种优势菌门可能是ARGs的主要潜在宿主。通过网络分析，构建了潜在病原体与ARGs、MGEs和DMF之间的关系（图6B），揭示了ARGs与潜在病原宿主的共现模式。12个属被鉴定为ARGs潜在病原体宿主，厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门与大多数ARGs和MGEs相关，如metXE、intI、blaOXA10-1、pikR2、tnpA等。图中看到DMF与芽孢杆菌呈显著正相关，属于厚壁菌门，表明DMF可能通过抑制其他菌株的生长而使芽孢杆菌具有竞争优势。此外，还发现伯克氏菌与intI之间存在很强的相关性。图6C在出水中仅检测到伯克氏菌和拟杆菌，这两个病原体关联的ARGs类型也减少了，伯克氏菌中检出3种，拟杆菌中检出1种。根据进水和出水ARGs的变化，大部分ARGs可以很容易地去除，然而，属于β-内酰胺类和MLSB类的ARGs在整个病原体中很难被消除。

图6 ARGs与宿主细菌的关系。

A：ARGs与宿主细菌的相关性分析；B：集水池中ARGs的关系图谱；C：二沉池中ARGs的关系图谱。

研究结论：

ARGs是世界上受到广泛关注的新型污染物，对于预防和治疗细菌感染至关重要，是一个日益严重的全球公共卫生安全问题，然而，工业污水处理厂作为ARGs的传播热点可能是被忽视的来源。生物处理通常用于去除细菌群落多样性高的污染物，而不考虑ARGs可以通过细菌间HGT传播。通过研究工业污水处理厂典型AAO过程中ARGs的分布和传播及其影响因素发现，多药、转座酶、磺胺类ARGs均显著升高，16S rRNA的丰度显著增加，污水处理期间产生了大约30%的新ARGs。这些结果表明，在工业污水处理厂降解DMF的过程中引入大量的微生物，其细菌群落的变化可能是形成ARGs的主要驱动因素。网络分析可以进一步确定ARGs与病原菌之间的相关性，结果表明，大部分病原菌在出水中减少，它们之间关联的ARGs也较少，然而一些ARGs可通过其在非致病细菌中的分布和积累对公众健康构成重大威胁，这些细菌可通过污水排放，可能需要采取进一步的措施来解决这一问题。

原名：The proliferation of antibiotic resistance genes (ARGs) and microbial communities in industrial wastewater treatment plant treating N,N-dimethylformamide (DMF) by AAO process

期刊：PLos One

IF2022：3.70

发表时间：2024.04.10

第一作者：高轩

原文链接：
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0