MST 微量热泳动技术：2024年高分文章案例分享 (三)

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MST 技术不需要将分子固定在固相表面，可以在游离状态测定蛋白、核酸、离子、化合物、纳米材料等分子间的亲和力 (Kd)。另外，由于 MST 技术使用毛细管进行实验，样品用量少，能够避免昂贵的样品消耗和繁琐的样品制备过程，因此相较于其它分子间相互作用检测技术，MST 技术能够大大降低样品成本。目前，MST 技术已发表文章高达8000+，其中不少文章发表在 Science、Nature、Cell 等期刊上。本文精选了两篇高分文章案例，为大家解读 MST 技术在科学研究中的应用。

案例一 MST 在人体抑癌基因(p53) 互作研究中的应用

2024年，苏州大学周芳芳研究团队在 Cell 杂志上发表了题为 “Alanyl-tRNA synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis” 的研究文章，揭示丙氨酸-tRNA 合成酶 AARS1 是细胞内的乳酰基转移酶，此外，他们的研究结果表明 AARS1 会通过调控抑癌蛋白 p53 的乳酰化修饰来抑制 p53 的抗肿瘤活性[1]。

首先，作者通过小鼠相关实验发现：肿瘤细胞产生的乳酸是细胞内一种自然存在的 p53 抑制分子，并通过全基因组 CRISPR 筛选确定了 AARS1 是肿瘤细胞中全局赖氨酸乳酸化的介质。为了验证 AARS1 蛋白与乳酸 (Lactate) 之间存在相互作用，作者采用微量热泳动 (MST) 实验证实 AARS1 蛋白 (EcAlaRS细菌酶、HsAlaRS 人源酶) 与乳酸发生结合，并且乳酸与 EcAlaRS、乳酸与 HsAlaRS 的 Kd 值分别为13 μM 和35 μM (图1A)。此外，小分子 Pull down 实验进一步证明了上述结果 (图1B)。这表明 EcAlaRS 和 HsAlaRS 可以使用乳酸作为底物直接进行乳酸化。

图1 乳酸与 AARS1 蛋白 (EcAlaRS 细菌酶、HsAlaRS 人源酶) 的互作研究

β-丙氨酸在结构上类似于乳酸，接下来，作者通过微量热泳动 (MST) 实验，研究了β-丙氨酸 (β-alanin) 与 AARS1 蛋白 (EcAlaRS细菌酶、HsAlaRS 人源酶) 的亲和力，测得β-丙氨酸与EcAlaRS、β-丙氨酸与 HsAlaRS 的 Kd 值分别为2.7 μM 和4.0 μM (图2A)。相较于乳酸，β-丙氨酸明显有着更强的亲和力 (图1A，图2A)。此外，作者通过竞争结合实验，证明β-丙氨酸可以抑制 AARS1 的乳酸化，从而阐明了生理上β-丙氨酸拮抗乳酸化的作用机制 (图2B)。

图2 (A) AASR1 与β-丙氨酸互作；(B) β-丙氨酸与乳酸竞争结合机制

接着，作者检索了来自 p53 相互作用蛋白的公开质谱数据，发现 AARS1 和目前已知的 p53 结合蛋白存在相互作用。并且采用了微量热泳动 (MST) 实验进一步证明了 AARS1 蛋白 (HsAlaRS 人源酶) 能与 p53 蛋白发生结合，亲和力 Kd 值为39 μM (图3)。

图3 AARS1 蛋白与 p53 蛋白互作

作者为了探究位于 p53 DNA 结合域位于 DNA 结合域 (DBD) 的 K120 和 K139 位点的乳酸化抑制 p53 活性作用机制。作者通过质谱分析和抗体识别确认了 p53 上乳酸化的残基是 K120 和 K139。采用微量热泳动 (MST) 实验直接比较了乳酸化 p53 (p53Lac) 与非乳酸化 p53 (Non-Lac) 对含有 p53 应答元件的 DNA (p53RE-DNA) 的亲和力。实验结果表明：与非乳酸化 p53 (Non-Lac) 实验组相比 (亲和力Kd值为 51nM)，乳酸化 p53 (p53K120-Lac、p53K139Lac 和 p53-Dual-Lac) 与 p53RE-DNA 的亲和力分别降低了约100倍、10倍和1000倍 (亲和力 Kd 值分别为860nM、7μM、35 μM) (图4)。之后的生化生理实验进一步表明 p53 的位点特异性乳酸化减弱了它们的 DNA 结合和液-液相分离 (LLPS)，从而降低了 p53 的抑瘤作用。

图4 p53 乳酸化减弱了其与 DNA 结合

此外，对 TP53 数据库(https://tp53.isb-cgc.org)和 COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer) 的分析显示 p53 存在包括 K120N、K120Q、K120E、K139N、K139T、K139Q 和 K139E 在内的癌症相关突变位点。作者通过微量热泳动 (MST) 实验发现：与野生型 (WT) p53 蛋白实验组相比 (亲和力Kd值为40 nM)，三种突变型 K120N、K120Q、K120E p53 蛋白与 p53RE-DNA 结合亲和力显著降低 (亲和力Kd值为192nM、317 nM、258 nM) (图5左)。同样的，与野生型 (WT) p53 蛋白实验组相比 (亲和力Kd值为42 nM)，另外四种突变型 K139N、K139T、K139Q K139E p53 蛋白与 p53RE-DNA 结合亲和力显著降低 (亲和力Kd值为122nM、201 nM、82 nM、556 nM) (图5中)。

综上所述， p53 蛋白突变后，与 p53RE-DNA 结合亲和力降低，其中 K120E 和 K139E 这两种突变型 p53 蛋白与 p53RE-DNA 结合亲和力下降得更为明显，表明 K-to-E 的突变导致更强的电荷减少。在进一步的生化活性实验中发现，K120N/Q 和 K139N/T/Q 的突变导致 p53 的部分功能丧失，而 K120E 和 K139E 的突变导致 p53 基因的功能几乎完全丧失 (图5右)，这些突变体表现出与 DNA 结合能力下降、液-液相分离（LLPS）减弱和转录活性降低的特征。其中，K120、K139 上的病理性突变 (肿瘤发生)与 p53 乳酸化 (肿瘤发展)都会导致其与 DNA 结合能力降低，从而活性丧失 (图5)，这一发现为在各种恶性肿瘤中观察到的突变型 p53 变体的功能受损提供了有力证据。

图5 Cy5-p53RE-DNA 与 p53 WT 及其突变蛋白互作(左), p53 中乳酸化与模拟突变(右)

此研究中进行了大量的微量热泳动 (MST) 实验，通过微量热泳动 (MST) 技术，来验证测定 AARS1 蛋白与肿瘤代谢产物 (乳酸) 的互作，确认 AARS1 与 p53 (蛋白与蛋白)互作的行为, 表征蛋白突变体功能上改变。结合其他生理生化实验完整详细地阐述了关键酶 AARS1 与肿瘤代谢物(乳酸)在肿瘤发生和发展中重要作用，揭示了 p53 乳酸化失活机制，提供了一种利用β-丙氨酸阻止 p53 乳酸化的方法，β-丙氨酸与乳酸竞争结合 AARS1，从而加强癌症治疗。

Microscale thermophoresis (MST)

Recombinant proteins dialyzed against MST buffer (PBS containing 0.05% tween) were labeled with MST fluorescence dye (NanoTemper MO-L018) according to the manufacturer’s instructions. Binding affinities between labeled proteins and lactate, target proteins, and fluorescently labeled ligand nucleic acids were measured in PBST binding buffer (PBS containing 0.05% tween) using a MONOLITH NT.115 system (NanoTemper Technologies) as indicated in the figures. Briefly, 10 mL of target protein was mixed with 10 mL of 2-fold serially diluted ligand at room temperature, and measurements were repeated on independent protein preparations to ensure reproducibility. The data were analyzed by plotting peptide concentrations against liquid-induced fluorescence changes (change in raw fluorescence on the Y axis). Curve fitting was performed by using GraphPad Prism 9 and the given Kd values were calculated with a 95% confidence level.

案例二 MST 在多元互作中的应用

2024年，山东农业大学张修国团队发表在 Nature Communications (IF:14.7) 上题为 A conserved oomycete effector RxLR23 triggers plant defense responses by targeting ERD15La to release NbNAC68 的研究揭示了辣椒疫霉效应蛋白 RxLR23 通过特异性结合到植物 ERD15La 蛋白，释放下游蛋白 NbNAC68，激活植物的免疫反应。

NbNAC68a、NbNAC68b和NbNAC68c，属于 NAC 转录因子大家族，介导生物和非生物胁迫的反应。作者研究发现 NbNAC68a/b/c 协同激活植物免疫通路。脱落酸和水杨酸途径的调节因子 ERD15La 是 NbNAC68 上游蛋白，通过微量热泳动 (MST) 发现 NbNAC68a、NbNAC68b、NbNAC68c 蛋白均可与 ERD15La 结合 (图6)，亲和力 Kd 值分别为1.23 μM、2.69 μM、4.54 μM (图6)。此次，研究发现 NbNAC68 触发的植物免疫被NbERD15La阻断，即ERD15La是NbNAC68a、NbNAC68b、NbNAC68c 引发的植物免疫的负调控因子。辣椒疫霉菌侵染植物后，其分泌的效应蛋白 RxLR23KM 可诱导植物细胞死亡和植物免疫。作者还通过微量热泳动 (MST)证明 RxLR23KM 特异性结合 ERD15La，结合能力较强，亲和力 Kd 值为0.48 μM (图6)。

图6 MST 技术测定 NbERD15La 直接结合 NbNAC68a、NbNAC68b、NbNAC68c、RxLR23KM

为了探究效应蛋白 RxLR23KM 对 NbERD15La 与 NbNAC68a、NbERD15La 与 NbNAC68b、NbERD15La 与 NbNAC68c 结合及对应通路的影响，作者采用 MST 技术进行三元 (RxLR23KM、NbERD15La 分别和NbNAC68a、NbNAC68b、NbNAC68c) 的检测，第三个分子 RxLR23KM 作为 buffer成分加入到NbERD15La与NbERD15La与NbNAC68a、NbNAC68b、NbNAC68c 结合互作检测体系中。结果分析表明，当检测体系中加入 RxLR23KM 后，NbERD15La 与 NbNAC68a、NbERD15La 与 NbNAC68b、NbERD15La 与 NbNAC68c 的 Kd 值增大，亲和力减弱。即 RxLR23KM 能显著抑制 NbERD15La 与NbNAC68a、NbERD15La与NbNAC68b、NbERD15La 与 NbNAC68c 结合的相互作用 (图7)

图7 通过 MST 检测 RxLR23KM 削弱 NbERD15La 与 NbNAC68a、NbNAC68b、NbNAC68c 的亲和力

作者构建了 RxLR23KM 与 NbNAC68 竞争结合 NbERD15La 激活植物防御反应的模型。NbNAC68 的活性通过与NbERD15La 结合而受到限制，植物防御反应受阻。在感染的早期阶段，效应蛋白 RxLR23KM 被递送到植物细胞中，RxLR23KM 干扰 NbNAC68 与 NbERD15La 的结合，释放 NbNAC68，进而激活免疫通路，限制病原菌的感染。

Microscale thermophoresis (MST)

For MST experiment, the equilibrium dissociation constant (Kd) values were measured using the Monolith NT.115 instrument (NanoTemper Technologies) referring to described previously. The RxLR23KM-HIS and NbNAC68a/b/c-HIS proteins were respectively fluorescently labeled according to manufacturer’s protocol using HIS-tag red channel (MO-L018). NbERD15La was diluted to the needed concentration (from 125 mM to 1.9 nM) and incubated with 200 nM of fluorescently labeled NbNAC68a/b/c-HIS or RxLR23KM-HIS protein for 15 min. To detect the interaction of NbERD15La with RxLR23KM and NbNAC68a/b/c, 40 mM of RxLR23KM protein was added into a complex mixture, containing NbNAC68a/b/c and NbERD15La. The samples were loaded into the NanoTemper glass capillaries (MO-K025) and microthermophoresis was carried out using 40% light emitting diode power. The Kd values were calculated using the mass action equation via the NanoTemper software from duplicate reads of measurements. Each experiment was repeated at least three times.

参考文献

[1] Zong, Zhi, et al. “Alanyl-tRNA synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis.” Cell 187.10 (2024): 2375-2392.

[2] Sheng, Hui, et al. “A conserved oomycete effector RxLR23 triggers plant defense responses by targeting ERD15La to release NbNAC68.” Nature Communications 15.1 (2024): 6336.

[3] Nano Temper 公众号