windows10环境下，primer premier 5怎么做引物设计

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不算创新，相关题材很多，只是写个教程而已；怎么绿色安装primer 5 ? 这个还请自行百度，搜搜也行，google更没得说；

有详细问题也可以站内信问问，不过大概率没多少时间在这打字(wx.188_9348-4389)…..

什么什么？windows10用不了primer 5？？不可能，试试大写锁定，试试英文输入法状态下运行软件，可以的；不会？我也没招。

下面进入正题：

1）要系统不报错，必须是英文环境下运行primer5，即大写锁定之后打开程序，或者打开primer5之后什么也别做，先切换输入法为英文，继续操作不会出错；

2）结果打印//导出，这个具有虚拟打印机功能的都可以，一般安装了wps、office pro plus、acrobat pro、foxit pdf reader等均会默认安装虚拟打印机；

3）输入核酸序列：长度需≤5000 bp，超过此范围可能会不支持；

4）引物设计过程：输入核酸序列后，依次点击  Primer–Search–选择参数；

5）参数选择：

Product size: qPCR长度理想状态81-150；不超过300bp； 普通PCR最好是300以上，3000以下；根据实际情况选择;

Sense primer/Anti sense primer即引物的位置，根据需要设置；

Primer Length: 引物长度，18-25bp均可；下面bp后面那个“？”，那是±的意思；这个参数可反复修改，直至找到合适的；

Search Mode：Automatic自动//Manual手动，均可；优先自动，自动条件下找不到合适的就该手动，一般都能找到合适的；

Search Parameters：重点说一下手动模式下的参数选择（这时候，说明评分很理想的不容易找到，那边放宽些条件：tm 55-68（推荐58-63，最起码不要低于50吧）； GC 30-70；degeneracy可不选；3‘ end stability可不选；其余默认即可，一般都会有可用引物出现。

设置好了点OK开始查找，弹出面板点OK出来结果；】

6）结果解读，对于标红的参数，绝对值小于6的基本均可忽略；

       Rating数值，没有95以上的行不行？80以下的能不能用？不要迷信这个，这些都不重要；个人从高分文章中摘到的引物，用其引用的NCBI原始序列，进行引物匹配，发现评分70多；人家也能做出来，且发好文章；因此这些不是最关键的，你最关键之之前的结果才最重要；

7）最后，及时Rating全100，也未必就能P出来好的结果，因为你真正跑pcr时，模板往往是整个基因组，这时，原先评分高的，现在不一定就高；存在一定的运气在里面；方案就是，多合成几对，比如一个目的基因，合3对或以上；总有好结果的。