微生物检验技术知识点

1微生物：是一群形体细小、结构简单、人肉眼看不见，必须借助于光学显微镜、电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能看到的生物。

2 微生物的种类：原核细胞型：细菌、放线菌、螺旋体、立克次氏体、支原体、衣原体；

• 真核细胞型：酵母菌、霉菌、微藻类等；

• 非细胞型：病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）。

3 病源微生物：感染人、动植物，导致疾病发生的有害微生物，称之为病原微生物。

4、微生物对产品的污染：对产品造成污染的微生物来源：土壤、空气、水、人和动植物、生产原料、生产器械及包装材料等

5 微生物检验的意义：

1）是衡量动植物性产品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检产品能否食用的科学依据之一。

2）通过微生物检验，可以判断产品加工环境及产品卫生环境，能够对产品被微生物污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。

3）微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒、人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。

6 微生物检验的范围与对象：

• 微生物检验<>范围

1.生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙壁等。

2.各种产品的原、辅料检验：包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。

3.各类产品加工、储藏、销售诸环节的检验：包括食品从业人员的卫生状况检验、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。

4.产品的检验：重要的是对出厂产品、可疑产品及食物中有毒食品的检验.

微生物检验<>对象 7类

(1)食品 (2)化妆品 (3)药品 (4)一次性用品及其他生活用品(5)应施检疫的出口动物产品 (6)环境 (7)有关国际条约或其他法律、法规规定的强制性卫生检验的进出口商品

我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项

大肠菌群是指示水质受粪便污染的指示菌，细菌总数指示水体受污染物污染的情况。

微生物检验常规技术包括显微技术，染色技术，灭菌和消毒技术，培养基制备技术，接种，分离纯化和培养技术，无菌取样技术，微生物的计数技术，菌种保藏技术，微生物常规鉴定技术等

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液涂在平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

菌落形成单位cfu，colony-forming unit 。

疏水网膜法(HGMF)：采用疏水网膜过滤样品，将捕获了被检微生物的疏水网膜上倾入适当的琼脂，经一定时间培养后即可计数

直接荧光过滤膜技术(DEFT)：将样品经特殊滤膜过滤后，经吖啶橙染色，利用紫外线显微镜来快速测定活菌数。

葡萄糖苷酶荧光法：通过在培养基中加入指示剂、色素、荧光物质，成为快速检验大肠菌群的常用方法。

第二章

第一节 微生物检验的基本程序

1 检验前的准备 2样品的采集 3样品的送检 4样品的处理方法

5 致病菌检验参考菌群的选择 6样品的检验 7检验结果的报告

检验前的准备

1. 准备好所需的各种仪器：如冰箱、恒温培养箱、显微镜等

2. 按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。

3. 准备好实验所需的各种试剂、药品，制备好普通营养琼脂或其他选择性培养基。根据需要分装试管或灭菌后倾注平板或保存在46℃ 的水浴中或保存在4℃ 的冰箱中备用。

4. 做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌30~60min。

5. 检验人员的工作衣、鞋、帽、口罩等灭菌后备用。

6. 工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。

微生物实验室检验 <>流 程

无菌取样—样品均质—样液稀释—样品接种—恒温培养—结果观察

食品微生物检测

常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、酵母总数、霉菌总数，此类细菌不致病，但会严重影响食品的外观及风味。目前常用微生物培养法来计数菌落，允许有该类菌落，但菌落总数不能超标。

致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等。致病微生物在食品中是绝对不允许存在的，所以快速检测食品中是否存在有致病微生物，是食品安全检验的重中之重。

食品微生物检验<>指标

我国卫生部颁布的食品微生物<>指标有菌落总数,大肠菌群和致病菌三项。
1.菌落总数：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。
2.大肠菌群：大肠菌群是寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，它随着的大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。
3.致病菌：致病菌既能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。
4.霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。
5.其它指标：还应包括病毒：肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒、猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标。

样品的采集目的：

便于食品卫生质量监督管理; 鉴别食品中是否存在有毒有害物质;

为新产品、新资源利用、新食品、新化工产品、新工艺在投产前进行卫生鉴定。

采样标签的填写

标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。

样品采集的种类

1. 大样，指一整批；

2. 中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；

3. 小样，又称检样，做分析用的，一般为25g

采样的步骤：

采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样 →样品封存 →开具采样证明

采样的要求

1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。

3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。

4、不得加入防腐剂、固定剂等。 5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。

检验样品：

食品生产环境如水、空气、土壤样品; 生产各工序样品如设备、管道;

各类食品 发生食物中毒时的样品

微生物检验的取样方案

1 ICMSF取样方案； 2 美国FDA的取样方案；

3世界粮农组织（FAO）取样方案；4 我国的食品取样方案。

①ICMSF取样方案

国际食品微生物规范委员会(简称ICMSF)的取样方案是依据事先给食品进行的危害程度划分来确定的。将所有食品分成3种危害度:

I类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品;

Ⅱ类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变;

Ⅲ 类危害：食用前经加热处理,危害减小的食品。

将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重3档。

根据以上危害度的分类，又将取样方案分成二级法和三级法。

二级法：设定取样数n,指标值m,超过指标值m的样品数为C,只要C>0,就判定整批产品不合格。

三级法：设定取样数n,指标值m,附加指标值M,介于m与M之间的样品数C。只要有一个样品值超过M或C规定的数就判整批产品不合格。

②美国FDA的取样方案

食品药品管理局(FDA)的取样方案与ICMSF的取样方案基本一致，所不同的是严重指标所取的15、30、60个样可以分别混合，混合的样品量最大不超过375g。也就是说所取的样品每个为100g，从中取出25g，然后将15个25g混合成一个375g样品，混匀后再取25g作为试样检验，剩余样品妥善保存备用。

食品微生物检验采样方法:

按照上述采样方案,能采取最小包装的样品就采取完整包装,必须拆包装取样的应按无菌操作进行。

不同类型的食品应采用不同的工具和方法:

1.液体样品：充分混匀,以无菌操作开启包装,用100mL无菌注射器抽取,注

入无菌容器。

2半固体样品：以无菌操作拆开包装,用无菌勺子从几个部位挖取样品,放入无菌容器。

3.固体食品：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取,割取时应兼顾表面与深部,注意样品的代表性; 小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品,放入无菌容器。 若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。

4.冷冻食品：大包装小块冷冻食品按小块个体采取;大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冻块上举取样品,也可以用无菌钻头钻取碎屑状样品,放入容器。 固体食品和冷冻食品的取样还应注意检验目的,若需检验食品污染情况,可取表层样品;若需检验其品质情况,应取深部样品。

5.生产工序监测

(1)车间用水。自来水样从车间各水龙头上采取冷却水;汤料等从车间容器不同部位用100mL无菌注射器抽取。

(2)车间台面、用具及加工人员手的卫生监测。用5cm2孔无菌采样板及5支无菌棉签擦拭25cm2面积。若所采表面干燥,则用无菌稀释液润湿棉签后擦拭;若表面有水,则用干棉签擦拭,擦拭后立即将棉签头用无菌剪刀剪入盛样容器。

(3)车间空气采样。直接降尘法。将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部,打开平皿盖5min,然后盖盖送检。

样品的送检要求

1、采集好的样品应及时送到食品微生物检验室：要快速运送，不要超过3小时；易变质的样品要冷藏，若路途遥远，无需冷冻样品可保持在1~5℃低温下运送；需保持冷冻状态的样品，可保存在泡沫塑料隔热箱，维持0℃。

2、样品送检时：必须认真填写送检申请单，以供检验人员参考。

3、送检过程：要注意防污染、防散漏、防变质。

4、检验人员接到送检单后 应立即登记,填写序号,并按检验要求,立即将样品放入冰箱或冰盒中,并积极准备条件进行检验。

5、食品微生物检验室必须备有专用冰箱存放样品 一般阳性样品发出报告后3d(特殊情况可适当延长)方能处理样品;进口食品的阳性样品,需保存6个月方能处理;阴性样品可及时处理。

样品的预处理方法

(一) 液体样品的处理

1瓶装液体样品的处理

用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用无菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。

2盒装或软塑料包装样品的处理

将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用无菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL ，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。

（二）固体样品的处理

1. 捣碎均质法：将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，8000~10000r/min均质1~2min即可。是对大部分食品样品都适用的办法。

2剪碎振摇法：将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和适量直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。

3研磨法：将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。

4整粒振摇法：完整自然保护膜的颗粒状样品(如蒜瓣、青豆等)

直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和适量直径5mm左右玻璃珠的无菌稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。

5胃蠕动均质法：这是国外使用的一种新型的均质样品的方法。

将一定量的样品和稀释液放入无菌均质袋中,开机均质。均质器有一个长方形金属盒,其旁安有金属叶板,可打击均质袋,金属叶板由一恒速马达带动,作前后移动而撞碎样品

（三）冷冻样品

冷冻样品，先将中样在0~4 ℃下解冻，时间不能超过18h，或在45 ℃ 下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。

菌落总数：

因微生物的生活特性各异，不可能在一种培养条件下全部生长，故检出的菌落数小于细菌总数，但仍可评定食品的污染程度，是常用方法。

菌落总数的食品卫生学意义：

作为食品被污染程度的指标，反映食品的新鲜程度；

预测食品的存放期限程度：食品生产过程中变质与否、食品生产过程中食品的一般卫生状况。

大肠菌群

食品中大肠菌群的数量测定：

一般采用100克或100毫升食品中的大肠菌群最可能数（MPN）来表示。

国标测定方法：乳糖九管发酵法。 不仅表明样品中有无粪便污染，另方面还可根据数量的多少，判定样品受污染的程度

致病菌检验参考菌群的选择

蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等

水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌

乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌

畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌

米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等

罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌

样品的检验过程

（一）、收样：

1、收到样品后逐一核对验收，登记编号。

如2004年收到的50号样品，编号可写成：

2、立即将样品放在冰箱或冰盒中，并积极做好准备工作。

（二）、检验

1、选择检验方法

国内：国家标准

国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准；

每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等

2、检验要求

（1）按照标准操作规程进行检验操作，边工作边做原始记录。

（2）检测结束，连同结果一起交同条线技术人员复核。复核过程中发现错误，复核人应通知检测人更正，然后重新复核。

（3）检测人和复核人在原始记录上签名，并编写“检测报告底稿”。

（4）所有检测项目完成后，检测人员将原始记录、样品卡、报告书底稿交科主任作全面校核。

3、样品的保留

（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；

（2）阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；

（3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理。

（4）微生物检验不进行复检

4检验结果的报告

1. 经审核后的报告底稿、样品卡、原始记录，上交打印正式报告二份 。

2. 将报告正本交审核人及批准人签名，并在报告书上盖上“检验专用章”CMA章和中心公章后对外发文。

3. 收文科室或收文人要在检测申请书上收件人一栏内签字，以示收到该报告的正式文本。

4. 在报告正式文本发出前，任何有关检测的数据、结果、原始记录都不得外传，否则作为违反保密制度论处。

第二节 微生物检验的常用仪器

显微镜 移液器、冰箱 超净工作台、灭菌锅 离心机

水浴锅、培养箱 烘箱或干燥箱 匀质器 各种玻璃器材

• （一） 普通显微镜的保养：

1、观察完后，移去观察的载玻片标本。

2、用过油浸镜，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着擦镜液擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。

3、转动“物镜转换器”，放在低倍镜的位置。

4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套

（二）培养箱

普通恒温培养箱 隔水式恒温培养箱 电热恒温培养箱

生化恒温培养箱 二氧化碳培养箱

培养箱的配置和使用：

配置：22（℃）、30（℃）、37（℃）培养箱各一个

使用注意事项：

(1)箱内不能放入过热或过冷的物品，取放物品时应快速进行并做到随手关闭箱门。

(2)内放一杯水，以保持湿度。

(3)培养物不能放在最底层，也不得放置过于拥挤。

(4)每月消毒一次，先用3%的来苏尔液涂布消毒，再用清水擦净。

(5)不得当烘箱使用。

（三）水浴锅：水浴锅内应注加蒸馏水而非自来水，使用时请注意水位

（四）匀质器：无菌均质器 高速匀浆机

（五）超净工作台：侧流式、直流式和外流式

超净台的使用和注意事项：

1使用前先打开紫外灯照射，紫外线照射时间40~60分钟；

2、使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；

3、请保持超净台整洁，不要堆积杂物；

4、使用完毕，勿忘关闭酒精灯；

5、请做好使用记录。

6、如遇故障，除记录在册外，还应及时与有关人员联系，尽早排除故障。

7、学期开始做无菌试验一次，以保证净化台正常使用。平时可根据情况，定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。

（六）离心机 ：普通离心机 高速离心机 超速离心机

转子：许多离心机可以配用不同大小的离心管，只需要改变转子或使用一个与不同的吊桶/适配器相配的转子。

1．水平转子：盛样品的离心管放在吊桶内，以转子的加速度运转。水平转子用于低速离心机，其主要缺陷是延长了沉淀的路径。同时，减速过程中产生的对流会引起沉淀物的重新悬浮。

2．角式转子：许多高速离心机及微量离心机安装。由于沉降路径短，沉淀颗粒时角式转子比水平转子的效率更高。

3．垂直管转子：用于高速及超高速离心机进行等密度梯度离心时。这种转子在沉淀没有形成之前不能用来收集悬浮液中的颗粒。

（七）灭菌器 ：干热灭菌器 湿热灭菌器

1、电烘箱（干燥箱）

用途： 用于玻璃器皿等耐热物品的烤干和灭菌。

玻璃器皿等物的灭菌，温度160~165℃，灭菌 2小时。

玻璃器材的干热灭菌方法：

(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用报纸包好，或装入特制的铁筒中。

(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。

(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。

(4)待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，继续加热至一定温度后，调节温度控制旋钮固定温度，在160℃—165℃保持2小时即可。

(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿。

2、高压灭菌锅

用途：培养基、生理盐水、废弃物、采样器、纱布、衣物的灭菌。

种类：手提式、立式、卧式杀菌锅

3 滤菌器

（八）普通冰箱冰柜

1、 取用冰箱冰柜内物品尽可能快，取完后及时将有用物品放回原处；

2、 关冰柜门时应轻轻合上，同时将门轻轻往外拉一下检查是否关好;

3、冰柜内的不要样品应及时清理

二、常用玻璃仪器及用具

（一）量器类

1、移液管1ml，2ml，5ml，10ml，25ml

2、容量瓶50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml

3、量筒 容量（ml）10、25、50、10、25、500、1000、2000

4、微量移液器

（二）其他常用玻璃器皿

1、培养皿3.5cm,7cm，9cm，15cm 2、试管

各种试管的使用：

13mm×100mm ：生化反应及凝集反应

15mm×150mm ：斜面培养

18mm×180mm：检样稀释

3、三角瓶 50mL，150mL，200mL， 250mL，500mL，1L，2L，3L

4、烧杯 容量（mL）：25、50、100、150、250、500、1000、2000、3000、5000

三、玻璃器皿的清洗和灭菌

(一)新购的玻璃器皿

1、先用热肥皂水刷洗，流水冲净。

2、再浸泡于１～２％的盐酸中数小时，最后用流水冲净

(二)用过的玻璃器皿

1、含油脂器材的清洗：

（1）单独高压灭菌； （2）趁热倒去污物；

（3）倒放在铺有吸水纸的篮子上，置100 ℃烘箱中烤0.5h;

（4）再用5%的碳酸氢钠水煮两次，再用肥皂水刷洗干净。

2、含菌试管的清洗

高压灭菌后，肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。

3、含菌平皿的灭菌

（1）底盖分开放，放入桶中，高压灭菌；

（2）趁热倒去污物；

（3）肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。

4、含菌吸管的清洗

（1）把含菌吸管投入3%的来苏尔液内浸泡30min以上杀菌；

（2）用肥皂水洗涤一次；

（3）最后用清水冲洗干净即可。

5、载玻片及盖玻片的清洗

（1）将载玻片及盖玻片分别浸入5 %的来苏尔液内浸泡过夜，取出水洗干净；

（2）盖片用软布擦干即可；

（3）染色用的载玻片要放入肥皂水中煮沸10min，再用肥皂水刷洗干净，最后用95%的酒精浸泡片刻，晾干备用。

（三）玻璃器材的灭菌

（1）清洗后烘干；

（2）加塞包扎；

（3）灭菌: 干热灭菌:160 ~165℃烘箱中烤2h 湿热灭菌:121 ℃ 20min

第三章 细菌生化试验和血清学试验

第一节 细菌常见的生化反应试验

（一）什么是生化试验?

Ø 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。

Ø 生化试验或称生化反应：细菌的酶不完全相同，对营养物质的分解能力不一致，因此其代谢产物各异。在培养基中加入可与被测终产物反应的指示剂，产生肉眼可见的变化，如颜色的改变等，利用生化方法来鉴定细菌的试验，统称为细菌的生化试验或称生化反应

（二）生化试验的方法：

1在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。

2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。

3根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。

4根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。

（三）生化试验的注意事项

1. 待检菌应是新鲜培养物，培养18~24h。

2. 待检菌应是纯种培养物。

3. 遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。

4. 应做必要的对照试验。

5. 提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。

（四） 检验细菌的生化试验范围

:1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验

3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验

二、糖醇类代谢试验

（一）糖醇类发酵试验

（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验

（三）V-P试验

（四）甲基红（Methyl Red）试验 MR

（五）七叶苷水解试验 （六）甘油品红试验

（一） 糖醇类发酵试验

1、原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖(醇)，有的只能分解1~2种糖(醇) ，有的分解糖(醇)能产酸产气，有的分解糖(醇)只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。

常用的糖醇

Ø 单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖

Ø 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖

Ø 三糖：棉子糖

Ø 多糖：菊糖、肝糖、淀粉

Ø 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇

2试验方法： 用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃ 培养1~3天，每天观察结果。

3、结果观察和记录：

• 产酸产气，阳性，以“⊕”表示

• 产酸不产气，阳性，以“+”表示

• 不产酸产气，阴性，以“-”表示

应用：沙门氏菌可发酵葡萄糖但不发酵乳糖。大肠埃希菌可发酵葡萄糖及乳糖。

有些菌可发酵同一种糖类，其发酵产生的代谢产物也不尽相同。如大肠埃希菌和志贺菌均可发酵葡萄糖，但前者产酸产气，而后者仅产酸，故可利用此试验来鉴定细菌。

（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验

1、原理：

细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。

氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；

发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；

不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。　

2、方法：

取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4h天，每天观察结果。

应用：可用于鉴别肠杆菌科细菌（发酵型）与非发酵菌（氧化型或产碱型）。也可用于鉴定葡萄球菌（发酵型）和微球菌（氧化型）。

3、结果观察与记录

（三） V-P试验

1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的O2氧化为二乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰与培养基中的蛋白胨中精氨酸等所含的胍基生成红色化合物，即V-P试验阳性，称V－P（+）反应。

应用：本试验常与甲基红试验一起使用。二者结果通常相反。即如大肠埃氏菌、沙门菌、志贺菌等甲基红呈阳性反应，而VP反应则为阴性。沙雷菌、阴沟肠杆菌等，VP反应为阳性，而甲基红反应为阴性。

2、试验方法

（1）奥梅拉（O’Meara）法 （2）贝立脱（Barritt）氏法 （3）快速法　

（１）奥梅拉法

Ø 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 ℃培养48h， 每1mL培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml，摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h ，或在48~50 ℃水浴放置2h后判定结果。

（2）贝立脱法

Ø 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃培养2天，每2mL培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1mL，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1 ℃培养 4h ，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。

（3）快速法

Ø 将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。

3、结果观察与记录

Ø （1）发酵管出现红色者，为阳性， 记V-P +

Ø （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P –

（四）甲基红试验（MR）

1、原理：　细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。

2、试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 ℃或30 ℃（以30 ℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1mL，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。

3、结果观察与记录

（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；

（2）呈橘黄色或黄色为阴性， 记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。

应用：主要用于大肠埃希菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）的鉴别。

• 肠杆菌中许多细菌甲基红试验为阳性，如沙门菌、志贺菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌等为阳性，但肠杆菌属和克雷伯菌属为阴性。

（五） 七叶苷水解试验

１、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。

2、试验方法：将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于36±1 ℃培养24h,观察结果。

3、结果观察与记录

Ø （1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为 +

Ø （2）培养基不变色者，为阴性，记录为 –

（六） 甘油品红试验

1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。

2、试验方法:取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于36±1 ℃培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。

3、结果观察与记录

Ø （1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+

Ø （2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-

三、氨基酸和蛋白质代谢试验

（一） 靛基质（吲哚）试验

1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

2、试验方法所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂或（2）欧-波试剂

Ø 将待检菌小量接种于培养基中，于36±1 ℃培养24~48h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。

Ø 或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。

3、结果观察与记录：

Ø 呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+

Ø 无红色者，为阴性反应，记-

（二） 硫化氢（H2S）试验

1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌

2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养基上，于36±1℃培养24~48h，观察结果。

3、结果观察与记录

Ø 培养基底部呈黑色，为阳性，记+

Ø 培养基底部无黑色，为阴性，记-

应用：用于肠道杆菌鉴定试验，如：沙门氏菌属、爱德华菌属、枸橼酸杆菌属及变形杆菌等为阳性；肠道杆菌中其他菌属为阴性，沙门菌属中的甲型副伤寒沙门菌也为阴性。

（三） 尿素酶试验

1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。

应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌尿素酶阳性，雷氏普罗威登斯菌和摩氏摩根菌阳性，斯氏和产碱普罗威登斯菌阴性。　

2、试验方法：挑取大量培养18~24h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。

3、结果观察与记录：

Ø 培养基变呈粉红色，为阳性，记 +

Ø 培养基颜色不变，为阴性，记 –

（四） 氨基酸脱羧酶试验

1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。

胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。

2、试验方法：取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在36±1 ℃培养1~4天，每天观察结果。

3、结果观察与记录：

Ø 试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记 +

Ø 试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记 -。

阳性反应试验管颜色变化过程：紫色→黄色→紫色

原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。

在培养的早期（10~12h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液pH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，pH又回升至碱性，指示剂显紫色。

应用：沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶试剂均为阳性。志贺菌除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志贺菌均阳性。故可作为肠杆菌科细菌鉴定的重要方法。此外，对链球菌和弧菌科细菌的鉴定也有重要价值。

（五） 苯丙氨酸脱氨酶试验

1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。

2、试验方法：从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在36±1 ℃培养18~24h后，加入氯化铁溶液4~5滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。

3、结果观察与记录

Ø 试验管立即出现绿色，为阳性，记 +

Ø 无色为阴性，记 -。

Ø 应用：本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌鉴定。变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属细菌均为强阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。

（六） 明胶液化试验

1、原理：有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。

2、试验方法：

Ø 挑取培养18~24h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。

Ø 另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置20~30min后，再观察结果。

3、结果观察与记录：

明胶液化，为阳性，+。

明胶凝固，为阴性，-。

四、 有机酸盐和铵盐的利用试验

碳源利用试验：细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验

（一） 枸橼酸盐利用试验

1、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。

2、试验方法：挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在36±1 ℃培养1~4天，每天观察结果。

3、结果观察与记录：

Ø 斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；

Ø 无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-

应用：枸橼酸盐利用试验用于肠杆菌科中各菌属间的鉴别，在肠杆菌科中，埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属等为阴性，其他菌属为阳性。

（二） 丙二酸盐利用试验

1.原理：某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。

2、试验方法：取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于36±1 ℃培养48h，观察结果。

3、结果观察与记录：

Ø 培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+

Ø 培养基无颜色变化,为阴性,记-

应用：常用于肠杆菌科细菌鉴定，亚利桑那和克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性反应，其他各属均为阴性。

Mimic试验：吲哚（I）、甲基红（M）、VP（Vi）、枸橼酸盐利用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。

I – 吲哚（indol）试验 M – 甲基红（methyl red）试验

Vi – VP（Voges-Proskauer）试验

C -枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验

I M Vi C试验

大肠埃希菌 + + – –

产气杆菌 – – + +

五、 呼吸酶类试验

（一） 氧化酶试验

1.原理： 氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和α-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。

试剂：1% α-萘酚-乙醇液 1%盐酸二甲基对苯二胺

2、试验方法：用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂1~2滴在培养物上,再加入1% α-萘酚-乙醇液1~2滴, 在30秒内判定试验结果。

3、结果观察与记录：

Ø 在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记 +

Ø 不变色或为红色者,为阴性,记 –

应用：奈瑟菌属的菌种均呈阳性反应。也用于区别假单胞菌与肠杆菌，肠杆菌科细菌为阴性，假单胞菌为阳性。莫拉菌属也为阳性。

Ø 本试验中避免接触含铁物质，否则易出现假阳性，选铜绿假单胞菌为阳性对照，大肠埃希菌为阴性对照。

（二） 过氧化氢酶（触酶）试验

1.原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。

2、试验方法：挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。

3、结果观察与记录：

Ø 产生气泡者，为阳性，记+

Ø 不产生气泡者，为阴性，记-

应用：绝大多数细菌均能产生过氧化氢酶，但链球菌属触酶阴性，故常用此试验来鉴别链球菌。

应注意本试验不宜用血琼脂平板上的菌落（易出现假阳性）。由于陈旧培养物可失去酶活性，所以试验应取新鲜培养菌。用金黄色葡萄球菌作阳性对照，阴性对照用链球菌。

（三）硝酸盐还原试验

1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与α-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应

试剂：A、对氨基苯磺酸试剂 B、α-萘胺试剂

2、试验方法：取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在36±1 ℃培养1~4天，每天取2mL培养液,加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。

3、结果观察与记录：

Ø 呈现红色，为阳性，记+

Ø 若无红色出现，为阴性，记-

（四） 氰化钾试验

1.原理： 氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.

2、试验方法:取培养20～24h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，36±1 ℃培养24～ 48h，观察结果。

3、结果观察与记录:

Ø 对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。

Ø 对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。

六、毒性酶类试验

（一） 溶血试验

1、原理: 某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。

2 试验方法: 平板法 试管法

（1）平板法:

将培养物接种于血平板培养基上，36±1 ℃培养24～ 48h，观察结果。

溶血试验的溶血类型及现象:

Ø （1） α（甲型）溶血: 菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。

Ø （2） β （乙型）溶血: 菌落周围出现较宽的透明溶血环。

Ø （3）γ（-丙型）溶血: 菌落周围无溶血环。

（2）试管法:

将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合，在36±1 ℃培养16～ 18h，观察结果。如溶血，培养液可出现透明状。

3、结果观察与记录:

Ø 有溶血现象，为阳性，记+；

Ø 无溶血现象，为阴性，记 –

(二) 链激酶试验

1、原理： A群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，而后溶解纤维蛋白，使血凝块溶解 ,为阳性反应。

此试验用于测定链球菌的致病性。阳性反应具有致病性。

2、试验方法：

Ø 吸取草酸钾血浆0.2 mL(0.01 g草酸钾加5 mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入0.8 mL生理盐水，混匀后，再加入待检菌36℃下培养18-24h肉汤培养物0.5 mL和0.25％氯化钙0.25 mL，混匀，放37℃水浴中，2 min观察一次。

Ø 待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2 h内不溶化，继续放置24 h后观察。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。

3、结果观察与记录；

Ø 如凝块全部溶化,为阳性+

Ø 凝块24 h仍不溶化,为阴性-

（三）卵磷脂酶试验

1、原理：某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。

2、试验方法：

（1）卵黄平板法

A法：将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，36±1 ℃培养3～ 6h，观察结果。

B 法：

先用卵黄磷脂酶抗血清将平板涂一半，置于36 ℃待干后，将待检菌接种于未涂抗血清的一半卵黄琼脂平板上，再转划已涂过抗血清的一半，36±1 ℃厌氧培养24～ 48h，观察结果。

在未涂抗血清的一半平板上，菌落周围形成较大的不透明乳白色混浊区，在涂抗血清的一半平板上，菌落周围无不透明混浊区，为阳性。

两边均无不透明区，为阴性。

乳糖卵黄琼脂平板,借以确定该菌可否产生卵磷脂酶。

卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相应抗血清所抑制，

（2）卵黄盐水法：

Ø 将庖肉培养基培养物经除菌过滤，收集滤液。在两支灭菌试管内，每管加入1%卵黄盐水0.4mL,在一管中加入滤液0.2mL，另一管加入生理盐水0.2mL作对照。在36 ℃ 水浴中，经2h、 4h、 8h、 24h观察结果。

Ø 管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。

3、结果观察与记录：

Ø 菌落周围形成较大的不透明区，为阳性。

Ø 两边均无不透明区，为阴性。

Ø 管底发生混浊沉淀，对照管无沉淀者，为阳性。

Ø 两管无沉淀者，为阴性。

（四） 血浆凝固酶试验

1、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。

2、试验方法

（1）玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5 min内,如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性;如两者呈均匀混浊，无凝固则为阴性。

（2）试管法：取灭菌小试管3支，各加入血浆①－无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml；其余2支作对照管，1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9％氯化钠溶0.5ml作空白对照。将3管同时放37℃温箱或水浴中培养，每0.5 h观察一次， 4 h 内无凝固现象者，观察直至24小时。

3、试管法的结果观察与记录：

Ø 空白对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性； 均无凝固则为阴性。

七、 三糖铁（TSI）试验

1、三糖铁试验的原理：

Ø 如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；

Ø 如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。

Ø 如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。

2、试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18~24h，观察结果。

第二节 细菌对抗菌药物敏感性的检验

1、扩散法：

Ø 琼脂加上细菌所需要的各种养料，将培养基融化后，倒入无菌培养皿中，冷却，凝成一个平面或叫平板(平皿)。这时将含有少数细菌的菌液涂到平板上，培养后细菌就会分别在平皿上繁殖，如果在平皿的培养基内事先加入抗生素纸片，由于药物在培养基中扩散，起了抑(杀)菌作用，形成了不长菌落的抑制圈。

Ø 抑制圈的大小，反映某一抗生素对该菌抑菌的程度。

K-B法：

最常用的药敏试验是WHO推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法(K-B法)。

该法将药敏试验抑菌环大小分为四个等级，即：敏感、中度敏感、中介度、耐药。

由于中介度介于敏感和耐药之间，所以不予报告，故化验单上只报告敏感、中度敏感或耐药。

【临床意义】

1．敏感：表示被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的该抗菌药物治愈，禁忌症除外。

2．中度敏感：表示被测菌株可以通过提高剂量被抑制或在药物被生理性浓集的部位被抑制，如β-内酰胺类药物。

3．中介度：这一范围只是抑菌环直径介于敏感和耐药之间的“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控所导致的较大的结果解释错误。抑菌环落入中介度范围，意义不明确，如果没有其他可替代的药物，应重复做药敏试验，或以稀释法测定MIC。

4．耐药：被测菌不能被常用剂量所达到组织内或血液中的抗生素所抑制。

5．最低抑菌浓度：抑制被测菌的最低药物浓度。

6．最低杀菌浓度：抗菌药物杀灭细菌所需的最低浓度。

联合药敏试验：

【临床意义】常用于严重感染时对两种或两种以上抗生素的选择。常用K-B法和方阵棋盘稀释法。结果以部分抑菌浓度FIC的指数报告。

Ø 1．FIC指数＜0．5，为协同作用。即两种抗菌药物联合后的药效大于同样浓度的两种药物抗菌作用的总和。 　　

Ø 2.FIC指数0．5～1，为相加作用，即两种药物联合后其活性等于两种药物抗菌作用的总和。

Ø 3．FIC指数1～2，为无关作用，即联合药物的活性与单独的抗菌作用相同。

Ø 4．FIC指数＞2，为拮抗作用，即两种药物联合后的抗菌活性小于单独一种药物的抗菌作用。

K-B纸片琼脂扩散法

（1）原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度。

Ø 在纸片周围可抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性。

(2) 制备抗菌药物纸片

Ø 专用药敏纸片：用加样或浸泡的方法使每片的药量达到一定的规定量，冷冻干燥后密封，-20°C保存备用。

（3）配制培养基

Ø 水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）琼脂是对生长较快的需氧和兼性厌氧菌进行药敏试验的标准培养基，pH7.2-7.4，琼脂厚度为4mm。

Ø 对营养要求较高的细菌进行药敏试验时，应在MH琼脂中加入相应的营养添加剂。

（4）细菌接种

Ø 接种物的准备可采用生长法或直接菌落悬液法。

Ø 为使药敏试验的接种浓度标准化,应使用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度，制备好的菌液应在15min内接种完毕。

Ø 置35℃孵育16-18h后读取结果，厌氧菌应孵育在含CO2的环境中，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h，以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。

（5） 结果解释和报告

Ø 用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径，参照NCCLS标准判断结果。常分为以下三级：敏感、中度敏感、低度敏感

（6）纸片法药敏结果的影响因素

Ø 培养基的质量对结果的准确性有直接影响，如pH、硬度、湿度和深度等；

Ø 药敏纸片的含药量是影响抑菌圈大小的重要因素；

Ø 接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一；

Ø 试验操作质量；培养条件和温度、时间；

Ø 抑菌圈测量工具的精确度；

Ø 质控菌株本身的药敏特性是否合格，有无变异。

（7）质量控制

Ø 采用标准菌株是进行药敏试验质量控制的主要措施。

Ø 常用的临床药敏质控标准菌株有：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠杆菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853 等。

2、稀释法

(1)液体稀释法

Ø 先将测试抗菌药物作一系列倍比稀释，然后各试管加入适当稀释的试验菌液，摇匀，经培养后观察，以抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)管，即为试验菌株的敏感度。

(2)琼脂稀释法：

Ø 　将不同剂量的抗菌药物，分别加于融化并冷至45℃的定量琼脂培养基中，混匀，倾注成无菌平板，即为含有药物浓度递减的培养基;

Ø 接种测试菌于该培养基上，经培养后观察，被检菌生长情况，最低药物抑制细菌生长者，即最小抑菌浓度(MIC)。

3、自动分析法

Ø 国内采用AUTOBAC仪器作细菌药敏测定，仪器由测定环药物纸片，培养振荡机及光度计主机等来检定数据，按耐药、中等耐药、敏感，并把最小抑菌浓度都打印出来。

Ø 该仪器仅适用于测定需氧菌及兼性厌氧菌，不适于专性厌氧菌及结核分枝杆菌的测试。

第三节 微生物培养及实验基本操作技术

一、培养基配制

培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。

配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。

注意事項 – 灭菌锅的使用

①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀

灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門

進入灭菌锅 之物品，蓋子不可關太緊或太鬆

拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套

培养基中的主要成分及其作用：

营养物质： N源、C源、无机盐、生长因子、水

常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏

常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖

双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）

水：用蒸馏水，不能用自来水 凝固剂：琼脂、明胶、血清等

抑制剂：

1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率

2、种类：

盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等

染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红

胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐

抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素

指示剂

1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。

2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。

培养基的类型：

l 根据培养基的物理状态来区分：

1、液体培养基 ：主要用于增菌培养、鉴别性培养

2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定

3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种

4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。

l 将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。

l 根据培养基的用途来区分：

Ø 增殖培养基 选择培养基 鉴别培养基

1、 增殖培养基： 在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。 能够给微生物提供较适当的生长环境从而使微生物大量繁殖的培养基称为增菌培养基。

增菌、运送用培养基

2、选择培养基 ：在培养基中加入抑制剂以杀死或抑制不需要的菌种,分离对象因对该抑制剂有抗性而正常生长繁殖的培养基,称之为选择培养基。

分离培养用的培养基

3、鉴别培养基：在培养基中加入指示剂或化学药品,目的菌经培养后其代谢产物与化学试剂发生显色反应,因而用肉眼可快速鉴别出目的菌,这样的培养基称之为鉴别培养基。

例如:伊红美蓝培养基(EMB)就是一种常用的鉴别性培养基。

伊红美蓝培养基用于食品、乳制品、水源和病源标本中革兰氏阴性肠道菌的分离和鉴别

鉴别用培养基

4、活体培养基：病毒、立克次氏体等专性寄生微生物不能在一般培养基上生长,常用鸡胚、活细胞和动物进行培养。

采用鸡胚培养时,将微生物接到绒毛尿囊膜、尿囊、羊膜囊和卵黄囊中进行培养,即可得培养物。 细胞培养指将病毒接种到体外培养的活细胞上使其增殖。

（三）培养基制备的基本方法和注意事项

• 培养基的制备记录 培养基成分的称取 培养基各成份的混合和溶化

• 培养基pH的初步调正 培养基的过滤澄清 培养基的分装

• 培养基的灭菌 培养基的质量测试 培养基的保存

1、培养基的制备记录

• 每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等。

• 记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。

2、培养基成分的称取

• 培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。

3、培养基各成份的混合和溶化

• 指示剂应在调节好pH值后再加入； 煮溶后要补加足水份；

• 不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。

4、培养基pH的校正

灭菌后pH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.1～0.2；

pH调整后，还应将培养基煮沸。

5、培养基的过滤澄清

• 液体培养基可用滤纸过滤法

• 琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤

６、培养基的分装

• 斜面： 1/５管 半固体培养基：1/3管

• 高层斜面：1/4～1/3管 平板：13~15ml

7、培养基的灭菌

（1）含糖类或明胶的培养基： 113℃灭菌15分钟或115℃灭菌10分钟。

（2）无糖培养基： 121℃灭菌15~20分钟。

（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。

（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃-60℃时取出，再摆置成适当斜面。

8、培养基的质量测试

（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。

（２）将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。

（３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。　　

9、培养基的保存

（1）基础培养基不能超过两周

（2）生化试验培养基不宜超过一周，

（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。

二、无菌技术

指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。 消毒灭菌技术是微生物检验最基本的试验技术之

灭菌：

应用物理或化学的方法杀死或除去物品上或环境中的所有微生物称为灭菌。

经过灭菌以后的物品,应该不存在具有生命力的微生物营养体及其芽孢、孢子,即处于无菌状态,否则就是灭菌不彻底。

消毒

应用物理或化学的方法杀死物体上或环境中绝大部分微生物(特别是病原微生物)。

物品消毒处理后,虽仍有少数微生物未被杀死,但已不致引起有害作用,故消毒实际上是不彻底的灭菌。

具有消毒作用的物质称为消毒剂。

消毒剂的杀菌作用是有限的,并不是所有的消毒剂都能将各种病原微生物杀死。

无菌：

指没有具有生命力的微生物存在的意思。

只有通过彻底灭菌,才能达到无菌要求。因此,灭菌是指对物品的作用,而无菌则是描述物品的状态。

灭菌是无菌的先决条件,无菌是灭菌后的结果

灭菌方法：物理方法：加热法、过滤除菌法 化学方法：化学消毒剂

（一）无菌环境：无菌室 无菌柜 超净工作台

1、无菌室：

（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间

（2）无菌室的消毒和防污染

• 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）.

• 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.

• 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。

2、超净工作台

超净台的使用与保养:

• （1）风速保持在0.32-0.48米/秒;

• （2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;

• （3）让超净台预工作10－15分钟;

• （4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.

（二）无菌器材

• 灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.

• 消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等

（三）无菌操作

1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；

• （2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。

2、进入无菌室前的准备

• （1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；

• （2）用紫外线灭菌处理30~60分钟；

• （3）检查无菌器材是否备齐；

• （4）洗手消毒；

• （5）手部消毒后，再穿戴无菌工作服。

3、检验操作过程的无菌操作要求

• （1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；

• （2）使用玻璃器皿应轻取轻放。

• （3）在正火焰上方操作；

• （4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；

• （5）在接种培养物时，协作应轻、准。

• （6）不能用嘴直接吸吹吸管。

• （7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。

斜面接种时的无菌操作

(1)接种环灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞

无菌操作 –斜面接种取菌技巧

1. 接種環前端镍絲部分以酒精燈烧红灭菌，後端鐵棒部分過火

2. 試管前端過火 3. 打開試管蓋 4. 試管傾斜，放入接種環

5. 試管前端過火，蓋上試管蓋 6. 接種環燒紅灭菌

无菌操作 – 平板接种取菌技巧

自 Plate 上取單一菌落 (方法一：蓋子微開遮住培养基，避免空氣中菌體掉入) 方法二：plate 反面拿起)

无菌操作 –吸球取菌技巧：

1. 擠出安全吸球內空氣，插上灭過菌之玻璃吸管

2. 向上為吸，向下為放

无菌操作 – 移液器取菌技巧

1. 調整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取範圍 200 ~ 1000μl)

2. 插上灭過菌之 Tip (用力插緊) 3. 按鈕壓至第一段 (不可壓至最底)

4. 深入液面下 2 ~ 4 mm 5. 慢慢釋放按鈕，即可 吸取液體

无菌操作 – 接菌技巧

1. 試管前端過火 2. 打開試管蓋

无菌操作 – 液体接菌技巧

方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌

方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液

方法三：以Pipetman 吸取菌液，按鈕壓至最底排出菌液

三、微生物的接种与分离、纯化技术

（一）接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

1、接种工具和方法

1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀

2、常用的接种方法

• １）划线接种 ２）点植接种 ３）穿刺接种 ４）倾注接种

• ５）涂布接种 ６）液体接种 ７）注射接种 ８）活体接种

(二)、分离纯化

1 稀释倾注平板法 ：

1、先稀释样品，加入平板2、倒平板时注意培养基温度 3、混合均匀

３、平板划线法：.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法

平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。

2、划线方法

四、微生物的培养方法

（一）一般培养法（需氧培养）

• 培养温度:25~37℃ ；接种后平板、试管、三角瓶，置于恒温培养箱

（二）、厌氧培养方法

1、简易的厌氧培养法：

• （1）庖肉培养法

• （2）铁丝圈厌氧培养法

• （3）焦性没食子酸法

2、厌氧罐法 3、厌氧手套箱法

A、厌氧缸法：厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。

• 接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养。

B、厌氧罐法：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。

（三）二氧化碳培养法

• 1、烛缸法 2、二氧化碳置換法

• 3、化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入

• 4、二氧化碳培养箱法

五、微生物培养特性观察与记录

• 在固体培养基上，观察： 菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。

• 在液体培养中：表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。

• 半固体培养基穿刺接种：观察运动、扩散情况。

1. 菌落形态观察

• 菌落特征:

(1)大小:大、中、小、针尖状,可用游标卡尺测量菌落的直径(mm)。

(2)颜色:黄、浅黄、乳白、灰白、红、粉红等。

(3)干湿:干燥、湿润、黏稠。

(4)质地:蜡状、液滴状、皱褶状等。

(5)形态:圆形、不规则等。

(6)表面:扁平、隆起、凹、凸、突脐状等。

(7)透明:透明、半透明、不透明。

(8)边缘:整齐、不整齐、圆锯齿状、裂叶、不定形。

六、染色技术

(一) 染色的基本原理

• 微生物染色的基本原理是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。

• 物理因素：如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。

• 化学因素：根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各种化学反应。

• 酸性物质对于碱性染料较易吸附,且吸附作用稳固;同样,碱性物质对酸性染料较易于吸附。

• 如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力,易于吸附。

(二) 染料的种类和选择

• 碱性染料：如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等；

• 酸性染料：如伊红、酸性复红或刚果红等；

• 中性染料：是上述两者的结合物,也叫复合染料,比如,伊红美蓝、伊红天青等。

(三) 染色方法

• 单染色法即只用一种染料对细菌着色。此法手续简便,但一般只能显示菌体的形态,功能较单一。

• 复染色法是使用两种及两种以上染料对细菌染色。

• 常用的方法有革兰氏染色法和抗酸染色法等。

(四)染色的基本程序

单细胞细菌染色为例

1.涂片：(1)在洁净无油脂的载玻片上滴一滴生理盐水(如果是液体菌悬液,则可不滴)。(2)用灭菌接种环挑取菌落少许至载玻片的生理盐水内,并轻轻涂布成薄薄的菌膜。若是菌液标本,则用无菌接种针直接涂布成菌膜。

2.干燥：涂布的标本,一般在室温下自然干燥。

• 若需加速干燥，则可在酒精灯火焰上方利用其热空气加温,切忌火烤和温度过高。

3.固定：细菌固定常用的是火焰加热法

• 将干燥涂片迅速通过火焰2~3次,温度不宜过高,以玻片背面触及皮肤有热感而不烫手为度。

4.染色：染色的目的是增大标本与环境的反差，便于在显微镜下观察。

• 以普通涂片标本的染色为例,就是将所需染色液滴加在标本上，以覆盖涂膜为够，达到所需染色时间，倾去染色液，水洗，吸干即可。

5.媒染：有的染色还需要增加媒染剂。以增大染料与被检标本物质的亲和力，或使染料更好地固定于被染标本。

• 媒染剂可用于细菌标本固定之后，也可包含在固定剂或染色液中，革兰氏染色中的碘液就是媒染剂。

6.脱色：使着色的染料脱去颜色称为脱色。能脱色的物质称为脱色剂。

• 在染色中,使用脱色剂的作用有的是起溶媒作用,有的是影响细菌蛋白质的电离度，改变电荷的性质和数量，因而影响染料的染色质量。

• 利用脱色剂主要是检查染料与细菌结合的稳定程度，作为鉴定染色之用。如革兰氏染色使用乙醇，就是鉴别不同的细菌。

• 使用脱色剂时，就是将脱色剂滴在经过染色的标本上，作用一定时间后，倾去脱色剂，水洗即成。有的脱色一定要掌握好时间，否则不能达到理想目的。

7.复染：在进行鉴别染色时,已经进行过脱色的标本，常需要复染剂重复染色1次，使复染剂与初染颜色形成鲜明对比。复染不宜太强，以免覆盖初染颜色。

常用的细菌染色法

1. 简单染色法：简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便,适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色。

简单染色方法:涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检

简单染色流程

(1)涂片：取一块干净的载玻片,并在其中央滴一小滴生理盐水(或无菌蒸馏水)。接种环在酒精灯上杀菌后从斜面挑取少量菌种(金黄色葡萄球菌或枯草杆菌)与玻片上的水滴混匀后,涂布成一均匀的薄层。涂布面一般以直径1cm大小范围为宜。

(2)干燥与固定：涂片最好在室温下使其自然干燥。亦可在酒精灯上微微加热,加速水分蒸发,但切勿过热。固定时,在酒精灯火焰外层尽快地来回通过2~3次,多为2~3s,以载玻片背面不觉烫手为宜,放置待冷后,进行染色。

(3)染色：在涂片上滴染色液一滴,使染色液覆盖涂片,染色约1min。

(4)水洗：斜置载玻片,在来自水龙头下用小股水线冲洗,直至洗下的水呈无色为止。

(5)干燥：用吸水纸吸去涂片边缘的水珠,置室温下自然干燥或微微加热,以加快干燥速度。注意用吸水纸时切勿将菌体擦掉。

(6)镜检：用显微镜观察,并用铅笔绘出细菌形态图。

2. 革兰氏染色法：革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

革兰氏染色是一种复染色法(由两种或多种染料染色的方法,称复染色法,又叫鉴别染色法)。

革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G¯表示。

革兰氏染色需要的试剂主要有草酸铵结晶紫染液、碘液、石炭酸复红染液、95%乙醇、番红染液、香柏油、二甲苯。

• 染色流程：制片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察

革兰氏染色流程

(1)制片。取大肠杆菌和枯草杆菌(均以无菌操作)分别做涂片。方法与简单染色法相同(取菌一定不要太多和涂片太厚,否则导致菌体重叠,难以观察)。

(2)初染。用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。

(3)媒染。滴加碘液媒染1min后水洗。

(4)脱色。将载玻片上水滴小心吸净后,滴加95%乙醇脱色,至流出的乙醇不现紫色为止,需时20~30s,随即水洗;或将乙醇滴满整个涂片,静置约30s,水洗,这样可节约乙醇。

(5)复染。用番红染液复染约1.5min后水洗。

(6)干燥。用吸水纸吸掉水滴,于室温下自然干燥。

(7)镜检。待标本片干后置显微镜下,用油镜观察,注意细菌细胞的颜色,并用铅笔绘出细菌形态图。

3. 芽孢染色法

细菌芽孢含水量很低,具有厚而致密的壁,其通透性比营养细胞低,着色和脱色均较困难,折光性很强。

除了用着色力强的染料外,还必须加热,以促进芽孢的着色,再使菌体脱色,而芽孢上的染料则难以渗出,故仍保留原有颜色,然后用另一种反差强烈的染料复染,使菌体和芽孢呈现出不同的颜色,明显地衬托出芽孢来。

具体方法有很多,如孔雀绿一番红染色法等。

细菌芽孢染色流程

(1)制备菌液： 加1~2滴无菌水于小试管中,用接种环从斜面上挑取2~3环苏云金杆菌或者枯草杆菌的菌体于试管中并充分打匀,制成浓稠的菌液。

(2)加染色液： 加5%孔雀绿水溶液2~3滴于小试管中,用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

(3)加热： 将此试管浸于沸水浴(烧杯),加热15~20min。

(4)涂片： 用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上,做成涂面,晾干。

(5)固定： 将涂片通过酒精灯火焰3次。

(6)脱色： 用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

(7)复染： 加番红水溶液染色5min后,倾去染色液,不用水洗,直接用吸水纸吸干。

（8）镜检： 先低倍,再高倍,最后用油镜观察。结果：芽孢呈绿色,芽孢囊和菌体为红色。

4. 鞭毛染色法

• 细菌鞭毛极细,其直径⊥般为10~20nm,只有用电子显微镜才能观察到。但是若采用特殊染色方法,则在普通光学显微镜下也能看到。

• 鞭毛染色法有很多,但基本原理相同,即在染色前先经媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色。

• 常用的媒染剂是由单宁酸和钾明矾或氯化铁等配制而成的一种不太稳定的胶体溶液,而染料可根据不同的方法有多种选择。

5. 荚膜染色法

• 荚膜是由多糖类衍生物和多肽聚集而成的,能溶于水,且自身含水量很高。

• 由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法对荚膜染色,即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色。因此,荚膜在菌体周围呈现一个透明圈,从而可以清晰地观察到荚膜的大小和形态。

• 荚膜染色法主要有番红染色法、湿墨水法、干墨水法和Tyler法等

1. 负染色法

• (1)制片： 取洁净的载玻片一块,加蒸馏水一滴,取少量胶质芽孢杆菌的菌体放人水滴中混匀并涂布。

• (2)干燥： 将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。

• (3)染色： 在涂面上加复红染色液染色2~3min。

• (4)水洗： 用水洗去复红染液。

• (5)干燥：。将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。

• (6)涂黑素： 在染色涂面左边加一小滴黑素,用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素,使黑素沿玻片边缘散开,然后向右一拖,使黑素在染色涂面上成为一薄层,并迅速风干。

• (7)镜检 先低倍镜、再高倍镜观察。

• 结果：背影灰色,菌体红色,荚膜无色透明。

2. 湿墨水法

(1)制菌液： 加1滴墨水于洁净的载玻片上,挑少量胶质芽孢杆菌的菌体与其充分混合均匀。

(2)加盖玻片： 放一清洁盖玻片于混合液上,然后在盖玻片上放一张滤纸,向下轻压,吸去多余的菌液。加盖玻片时不可有气泡,否则会影响观察。

(3)镜检： 先用低倍镜、再用高倍镜观察。

结果：背景灰色,菌体较暗,在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。

3. 干墨水法

(1)制菌液： 加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端,挑少量胶质芽孢杆菌的菌体与其充分混合,再加1滴墨水,充分混匀。

（2）制片： 左手执玻片,右手另拿一边缘光滑的载玻片,将载玻片的一边与菌液接触,使菌液沿玻片接触处散开,然后以30°角,迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端,使菌液铺成一薄膜。

(3)干燥： 空气中自然干燥。

(4)固定： 用甲醇浸没涂片,固定1min,立即倾去甲醇。

(5)干燥： 在酒精灯上方,用文火干燥,不可使玻片发热。

(6)染色： 用甲基紫染1~2min。

(7)水洗： 用自来水轻洗,自然干燥。

(8)镜检： 先用低倍镜、再高倍镜观察。

结果：背景灰色,菌体紫色,荚膜呈一清晰透明圈。

6. 霉菌的染色

• 霉菌菌丝较粗大,细胞易收缩变形,且孢子容易飞散,所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。

• 此染色液制成的霉菌标本片的特点是:细胞不变形,具有杀菌防腐作用,且不易干燥,能保持较长时间,溶液本身呈蓝色,有一定染色效果。

七、显微技术

• 在实验室中常用的有:普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。

通常在我们观察细菌、放线菌以及真菌等相对较大的微生物时,可以采用普通光学显微镜。普通光学显微镜通常能将物体放1500~2000倍。

八、微生物计数法

• 显微直接计数法：利用血细胞计数板在显微镜下直接计数,能立即得到数值,但死活细胞都计数在内。

• 平板计数法：是平板上长成菌落后再计数,反应较真实,但费时太长。

（一）微生物直接计数法

• 利用血细胞计数板进行直接计数。

• 计数前需对样品做适当稀释,然后将经过适当稀释的菌悬液(或孢子悬液)放在血细胞计数板的计数室内,按照在显微镜下观察到的微生物数目代入计算公式运算后,即可得出单位体积微生物总数目。

• 此法的优点是直观、快速。

• 用于直接测数的菌悬液浓度一般不宜过低或过高(常大于106个/mL)。活跃运动的细菌应现用甲醛杀死或适度加热以停止其运动。

• 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质,常不易分辨。

• 菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。

• 两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜,计数板下部的细菌不易看清。

• 每个方格网共分九个大方格,中间的方格即为计数区。

• 计数区分为16个中方格,而每个中方格又分成25个小方格，即计数区都由400个小方格组成。

• 每毫升菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数(N)× 系数(Κ )× 菌液稀释倍数(d)。 系数K=400× 104

血细胞计数板的便用

(1)稀释菌液：根据待测菌悬液浓度,加无菌水适当稀释,目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4~5个酵母细胞为宜,一般稀释100倍即可。

(2)准备计数板：取清洁干燥的血细胞计数板(使用前可通过显微镜检验计数板上有无污物,若有,则需清洗后才能进行计数),在中央的计数室上加盖专用的盖玻片。

(3)加样：将稀释后的酵母菌悬液摇匀,用滴管吸取一滴置于盖玻片的边缘(不宜过多),让菌悬液沿缝隙靠毛细渗透作用缓缓渗入计数室,勿使气泡产生,并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。 也可以将菌悬液直接滴加在计数区上,不要使计数区两边平台沾上菌悬液,以免加盖盖玻片后,造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片(勿使气泡产生)。

(4)计数：静置片刻(一般为5~10min ,使酵母菌全部沉降到血细胞计数室内。将血细胞计数板置于载物台上夹稳,先在低倍镜下找到计数室后,再换成高倍镜观察并计数。 由于活细胞在显微镜下是透明的,光照强度过大时难以辨别,所以观察时应减弱光照的强度

计算公式

血细胞计数板的清洗与保藏

(1)血细胞计数板使用后,取下盖玻片,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格刻度。洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。

(2)计数板冲洗后,还要通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净,则必须重复清洗直到干净,干燥后方可放入盒内保存。

（二）稀释平板计数法(或活菌计数法)

在理论上可以认为在高度稀释条件下的每一个活的单细胞均能繁殖成一个菌落,因而可以用培养的方法使每个活细胞生长成一个单独的菌落,并通过长出的菌落数去推算菌悬液中的活菌数。缺点是比较麻烦,费工费时,而且在混合微生物样品中只能测定占优势的并能在供试培养基上生长的类群,测定值常受各种因素的影响。

一般细菌的平板菌落计数以30~300个为宜

（三）最大可能数计数法又称液体稀释培养计数法。

• 本法适用于测定在一个混杂的微生物群中虽不占优势,但却具有特殊生理功能的类群。

• 其特点：是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰,并通过该生理功能的表现来判断该群微生物的存在和丰度。

• 本法特别适合于测定土壤微生物中特定生理群(如氨化菌、硝化菌、纤维素分解菌、自生固氮菌、根瘤菌、硫化细菌和反硫化细菌等)的数量和检测牛奶及其他食品中特殊微生物类群的数量。

• 其缺点是只能进行特殊生理群的测定,结果偏差较大

（四）比浊法

原理：根据在一定的浓度范围内,菌悬液中的微生物细胞浓度与液体的光密度成正比,与透光度成反比。 可使用光电比色计测定。

由于细胞浓度仅在一定范围内与光密度成直线关系,因此,待测菌悬液的细胞浓度不应过低或过高,培养液的色调也不宜过深,颗粒性杂质的数量应尽量减少。

本法常用于观察和控制在培养过程中微生物的菌数消长情况。如,细菌生长曲线的测定和发酵罐中的细菌生长量控制等。其优缺点与直接测数法相同。

（五）浓缩法(膜过滤法)

本法适用于检测微生物数量很少的水和空气等样品。测定时让定量的水或空气通过特殊的微生物收集装置(如微孔滤膜等),富集其中的微生物,然后将滤膜干燥、染色,并经处理使膜透明,再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数。或将收集的微生物洗脱后测数,再换算成原来水或空气中的数量。

九、菌种保藏技术

根据菌种的生理生化特点,创造一个有利于其休眠或代谢活动处于最低的环境条件,即低温、干燥、缺乏氧气和养料,以及添加保护剂等,使微生物的代谢活动处于最低的状态,但又不至于死亡,从而达到保藏的目的。

依据不同的菌种或不同的需求,应该选用不同的保藏方法。

一般情况下,斜面保藏、半固体穿刺、液体石蜡保藏法和砂土管保藏法较为常用,也比较容易制作。

（一）常规保藏方法

1、斜面保藏法

• 操作步骤：标记试管→接种→培养→保藏

将菌种转接在适宜固体斜面培养基上,待其充分生长后, 置4℃ 冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2~4个月移种1次,酵母菌间隔两个月,普通细菌1个月,假单胞菌两周传代1次。

2、半固体穿刺保藏法

• 按穿刺接种方式培养菌种,菌种长好后用胶塞封严,置4℃ 的冰箱存放。

• 操作步骤：标记试管→穿刺接种→培养→保藏。

• ①贴标签。取无菌的半固体肉汤蛋白胨直立柱数支,贴上标签,注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。

• ②穿刺接种。用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种,朝直立柱中央直刺至试管底部,然后又沿原线拉出。

• ③培养。置37℃ 恒温箱中培养48h。

• ④保藏。半固体直立柱长好以后,放入4℃ 的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。

3、液体石蜡保藏法

• 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上,其用量以高出斜面顶端1cm为准,使菌种与空气隔绝。将试管直立,置低温或室温下保存。

• 霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死,酵母菌可保藏1~2年,一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌,在37℃温箱内,也可保藏3个月之久。

• 优点：制作简单,不需特殊设备,且不需经常移种,还可防止干燥。

• 缺点：保存时必须直立放置,所占位置较大,同时也不便携带。

• 从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意。

4、砂土管保藏

此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果较好,可保存几年时间,但对营养细胞效果不佳。

操作步骤：河砂处理与土壤处理→砂土混合→灭菌→无菌检查→制各菌悬液→加样→干燥→保藏。

5、滤纸保藏法

细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏。前两者可保藏2年左右,有些丝状真菌甚至可保藏14~17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便,不需要特殊设备。

将滤纸剪成0.5cm× 1.2cm的小条,装入0.6cm× 8cm的安瓿管中,每管1~2张,塞以棉塞,121℃ 灭菌30min。将需要保存的菌种,在适宜的斜面培养基上培养,充分生长。

取灭菌脱脂牛乳(脱脂牛乳的处理：牛乳2000r/min离心10min脱脂,然后115℃ 灭菌20min,或间歇灭菌3次,经检查无菌后备用)1~2mL滴加在灭菌培养皿或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液。

用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内,使其吸饱,再放回至安瓿管中,塞上棉塞。将安瓿管放入内有P2O5作吸水剂的干燥器中,用真空泵抽气至干。

将棉花塞入管内,用火熔封,保存于低温下。需要使用菌种,复活培养时,可将安瓿管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻璃破裂,再用镊子敲掉口端的玻璃,待安瓿管开启后,取出滤纸,放入液体培养基内,置温箱中培养。

（二）真空冷冻干燥保藏方法

利用有利于菌种保藏的一切因素,先将微生物在极低温度(-70℃ 左右)下快速冷冻,然后减压下利用升华现象除去水分(真空干燥),使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下,因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。

适用于菌种长期保存,一般可保存数年至十余年。但设备和操作都比较复杂。

操作流程：准备安瓿管→准备脱脂乳→准备菌种→制备菌悬液→分装样品→冷冻→真空干燥→封管→存活性检测→保藏→活化。

安瓿管先用2%HCl浸泡,再水洗多次,烘干。

将标签放入安瓿管内,管口塞上棉花,121℃ 灭菌30min,备用。

一般,细菌要求24~48h的培养物;酵母需培养3d;形成孢子的微生物则宜保存;放线菌与丝状真菌则培养7~10d。

第四章 细菌常规检验 各论

第一节 食品卫生的细菌检验

一、菌落总数：是指样品经过处理，在一定条件下培养后,所得1mL(g)或1cm2面积样品中所含菌落的总数。

2、菌落总数测定的意义

u 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。

u 预测食品存用的期限长短。

u 了解细菌在食品中的繁殖动态。

3、菌落总数测定的方法

u 平板倾注法 平板表面涂布法 平板表面点滴法

4、平板倾注法测定菌落总数

Ø 检验步骤(程序)：检样→稀释处理→做平板→培养→菌落计数→报告结果

Ø 注意：检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。

（2）培养

Ø 普通食品：37 ℃ 48h 倒放平板

Ø 清凉饮料、调味品、糕点、酒类：37 ℃ 24h

Ø 水产品：30℃ 48h

（3）计数和报告

Ø 到达规定培养时间，应立即计数。

Ø 如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。

菌落的选择

Ø 单个菌做一个菌落计

Ø 呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。

Ø 如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。

平板菌落计数的选择

Ø 选取菌落数在30～300之间的平板（SN标准要求为25～250个菌落），若有二个稀释度均在30～300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字。

Ø 如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

Ø 如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告。

Ø 如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30～300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

Ø 如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。

菌落数的报告

Ø 菌落数在1～100时，按实有数字报告，

Ø 如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。

Ø 固体检样以克（g)为单位报告，

Ø 液体检样以毫升（mL）为单位报告，

Ø 表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。

(4) 检验注意事项

对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；

吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；

吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整时要使管尖与容器内壁紧贴;

进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触;

检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.

稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。

二、大肠菌群

1、 什么是大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。

2、大肠菌群的组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。

3、大肠菌群的测定意义

u 粪便污染的指标菌：大肠菌群或粪大肠菌群

u 以大肠菌群作为粪便指标菌原因：

1) 在粪便中数量最大；

2) 在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；

3) 检测方法简便容易。

u 大肠菌群的测定意义：

1) 判断食品中否受到粪便污染。

2) 有利于控制肠道传染病的发生和流行。

3) 有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。

4、大肠菌群的生物学特性

1 形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。

2 发酵乳糖产酸产气

3 培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；

4 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。

5、大肠菌群检验方法及操作方法

u 国家标准：

u 三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)

u 行业标准：

u 两步法：推测试验→证实试验

表1 大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征

MPN法简介 Most Probable Number Method最大可能数

• 对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。

• MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。

6、粪大肠菌群的检验

• 粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

• 于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃ 24h产气的一群细菌；在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群。

检验方法：

7、检验注意事项

1）从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。

2）对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。

3）挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2个以上的典型菌落或非典型菌落进行接种。

4）不可用其他胆盐代替指定的胆盐。

8、大肠菌群快速检验

食品大肠菌群快速检验方法：

• TTC显色法 DC试管法 纸片法

（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片

使用方法：

1.样品稀释同国标法

2.接种

Ø 饮料和饮用水采用原液、1:10、 1:100三个稀释度

Ø 固体食品采用1:1 、1:10和1:100三个稀释度。

Ø 用1亳升灭菌吸管吸取1亳升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。

3.培养

Ø 将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在36℃下培养15－24h观察结果。

4.结果判定

Ø 纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者,为阳性.

Ø 纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性.

Ø 纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性.

Ø 酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色斑点为阴性

（二）餐具大肠菌群快速检验(纸片法)

使 用 方 法 ：

1.采样6-10份：碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，30秒后取下，置于原塑料袋内。筷子以5只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内。

2.将已采样的纸样置于37°C培养15小时：纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格。

（三）水的大肠菌群检验

1、水样的采集

1）自来水（未含氯）：龙头火烧灭菌，畅流5—10′后取样。

2）地面水源水：江湖河，水库，水池等。浸入水下20cm下取样。水井50cm下取样。

3）漂白粉处理的水样：自来水，游泳池水，应在瓶内加入0.03g硫代硫酸钠/500ml，或2ml 1.5%硫代硫酸钠液/500ml，除氯。

4）运送：2小时内送到检验室。6-10℃，<6h,立即检验.

5）检验前：将水样振摇5-10分钟。

2、生活饮用水或食品生产用水的检验（大肠菌群 ）

3、瓶装矿泉水的检验
（大肠菌群 ）

4、水源水的检验

接种量

Ø 严重污染水：1、0.1、 0.01、 0. 001ml各1份 总量：1.111ml

Ø 中度污染水：10、 1、0.1、 0.01ml各1份 总量：11.11ml

Ø 轻度污染水：100、 10、 1、0.1ml各1份 总量：111.1ml

大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下

• 如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。

第三节 病原性球菌的检验

一、葡萄球菌属 Staphylococcus

n 广泛存在于自然界，多数是不致病的腐物寄生菌。

n 致病性葡萄球菌可引起化脓性炎症、败血症、食物中毒等。

分类与分型

1）金黄色葡萄球菌(S. aureus)：多数致病。

（2）表皮葡萄球菌(S. epidermidis)：偶可致病。

（3）腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)：不致病。

（4）致病性菌株能产生黄色或柠檬色素。

（5）多数金黄色葡萄球菌可被相应噬菌体裂解，表皮葡萄球菌不敏感。

金黄色葡萄球菌的致病性

n 用噬菌体可将金葡萄菌分为4群23个型。

n 肠毒素型食物中毒由Ⅲ和Ⅳ群金葡萄菌引起，Ⅱ群菌对抗生素产生耐药性的速度比Ⅰ和Ⅳ群缓慢很多。

n 造成医院感染严重流行的是Ⅰ群中的52、52A、80和81型菌株。

n 引起疱疹性和剥脱性皮炎的菌株经常是Ⅱ群71型。

金黄色葡萄球菌的流行病学

n 作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。

金黄色葡萄球菌及其检验

n 革兰氏阳性球状，排列呈葡萄串状。无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，个别形成荚膜。致病性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）菌体较小、约0.5~1um., 普通0.4~1.2um。

培养及生化特性

1.在普通培养基上生长良好（需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃、pH7.4 ，对营养要求不高，加少量葡萄糖或血液生长更旺盛。 ），在麦康凯琼脂平板不生长。

2. 血平板上生长更佳，致病菌株β溶血 3. 产生金黄色色素

4. 高度耐盐: 可在7.5~15%NaCl肉汤中生长。

5. 分解葡、乳、麦、蔗糖， 产酸不产气，触酶阳性，致病菌株能分解甘露醇。

6. 金黄色葡萄球菌能产生的毒素和酶 （致病因素P149）

1）溶血毒素 2）杀白细胞素

3）血浆凝固酶：区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志。

4）脱氧核糖核酸酶： 5）肠毒素 6）溶纤维蛋白酶 7）透明质酸酶

抗原性

1. 多糖抗原：具有群特异性，存在于细胞壁，借此可分群。

Ø A群多糖抗原化学组成为磷壁酸中的N-乙酰葡糖胺核糖醇残基（金黄色葡萄球菌）。

Ø B群多糖抗原化学组成是磷壁酸中的N-乙酰葡糖胺甘油残基。

2. 蛋白质抗原：细胞壁的一种表面蛋白，人源菌株含SPA（Staphylococcus protein A)，能与多种哺乳动物IgG Fc片段非特异性结合。Ag-Ab(IgG)-SPA 有利于多种微生物抗原检出。

3. 荚膜抗原：几乎所有金黄色葡萄球菌菌株的表面均有荚膜多糖抗原的存在。仅个别表皮葡萄球菌有此抗原，抗吞噬作用。

磷壁酸：以磷酸多元醇分子的重复结构单位为主链（骨架）的阴离子多聚物。磷壁酸按磷酸多元醇分子的不同分为5种类型，其中以磷酸甘油和磷酸核糖醇两大类最常见。

抵抗力

Ø 抵抗力较强，能在干燥脓汁或血液中存活数月，80℃ 30min可杀死，煮沸迅速死亡，对多种抗生素产生耐药性。

Ø 临床上用1%-3%的龙胆紫溶液治疗，以防止葡萄球菌引起的化脓症。

致病性和毒力因子

1. 致病性：可引起两类疾病

n 侵袭性疾病：主要引起化脓性炎症。通过各种途径侵入机体，导致皮肤或器官的多种感染，甚至败血症。

n 中毒性疾病：由葡萄球菌产生的外毒素引起。人源多为α毒素，动物源则为β毒素。

2.毒力因子: 包括毒素和酶

(1)α毒素(Alphatoxin)

损伤细胞膜的毒素，对多种哺乳动物红细胞有溶血作用，对白细胞、血小板、肝细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞等均有损伤作用

(2)肠毒素(enterotoxin)

按抗原性不同，分为A、B、C1、C2、C3、D和E 7个血清型，均可引起急性胃肠炎，即呕吐为主要症状的食物中毒。

• 肠毒素形成条件：

• 存放温度：在37℃内，温度越高，产毒时间越短；

• 存放地点：通风不良氧分压低易形成肠毒素；

• 食物种类：含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。

(3)凝固酶

能使含有抗凝剂的人或兔血浆发生凝集的酶类物质。致病性菌株多数为凝固酶阳性。

①游离凝固酶(free coagulase): 使液态纤维蛋白原变成固态纤维蛋白。

②结合凝固酶(bound coagulase): 使纤维蛋白原与菌体交联而致细菌凝聚。作用：有助于致病菌株抵抗吞噬细胞和杀菌物质。

(4)耐热DNA酶:100℃，15min不失去活性，由致病性菌株产生。

（5）其它致病因子：溶纤维蛋白酶、纤维蛋白溶酶、透明质酸酶，杀白细胞素、磷酸酶、卵磷脂酶和脂酶等，利于细菌扩散。

微生物学诊断

n 标本的采集： 化脓性病灶采取脓汁、渗出液； 败血症采取血液；脑膜炎采取脑脊液；食物中毒则分别采集剩余的食物、呕吐物和粪便。

n 直接涂片检查： 注意浓汁、乳汁、液体培养的染色片中常见双球或短链排列的球菌，易误认为是链球菌。

n 分离培养 ： 普通平板培养、血液琼脂平板、高盐培养基。

鉴定：纯培养物菌落金黄色，周围呈溶血现象。

1 致病性葡萄球菌的鉴定：

（1）产生凝固酶和耐热DNA酶

（2）产生金黄色色素，有溶血性 （3）发酵甘露醇

2 葡萄球菌肠毒素的检查：

细菌分离鉴定的同时，接种至肉汤培养基，培养后取滤液注射至6-8周龄的幼猫。ELISA法检测微量肠毒素，PCR或DNA杂交检测产毒素菌株

金黄色葡萄球菌的检验

方法：增菌培养法、直接计算法

1、增菌培养法的检验步骤（程序）

检样→稀释→7.5%NaCl 肉汤增菌培养 →血平板、B-P分离→镜检、 血浆凝固酶试验→报告结果

2、检验操作要点

1）增菌：7.5%NaCl肉汤，37℃24h，呈均匀浑浊生长。

2）平板分离：血平板,37℃ 24~48h

Ø 菌落成金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有透明溶血圈（β型）

B-P平板：

主要成分及作用：　

氯化锂、甘氨酸：抑制非致病性葡萄球菌的生长；

丙酮酸钠:：促进葡萄球菌生长

亚碲酸钾： 抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色

卵黄:：含蛋白质、卵磷、脂肪。

在B-P平板上的菌落特征: 为圆形，光滑凸起、湿润、Ф2-3mm，呈灰色至黑色，边缘色淡周围为浑浊带，在其外层有一透明带。

3）镜检与血浆凝固酶试验

• 从B-P平板上挑取金黄色葡萄球菌的菌落进行镜检

• 如发现葡萄球菌,再做血浆凝固酶试验

• 做血浆凝固酶试验

4）结果报告

方式：（1）初步报告：根据血平板培养计数和镜检，如发现有G+葡萄串状球菌存在，且有溶血性，则初步报告为：“有金黄色葡萄球菌存在，1g样品约含多少。” （2）结果报告：根据培养特性、镜检、生化试验、动物试验结果，可报告为：“是否是致病性葡萄球菌” .

二、链球菌属 Streptococcus

Ø 链球菌(Streptococcus)是化脓性球菌的另一类常见的细菌，广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部，引起各种化脓性炎症、猩红热、丹毒、败血症、脑膜炎、产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。

（一）生物学性状

1、形态与染色

革兰氏阳性；球形或卵圆形，直径0.6～1.0μm。链状排列，短者4-8个细菌，长者有20～30个细菌。菌链的长短与菌种及生长环境有关:

（1）致病菌株较长，非致病菌株较短；
（2）固体培养基多为短链，液体培养基常为长链；
（3）病料多呈长链，但败血症猪体分离的多为成双或短链。　　

Ø A、B、C、D群中，多数菌株在血液或血清培养基上的幼龄培养菌或病料中的菌体常见荚膜。除D群一些菌株外，无芽胞, 无鞭毛。

2、培养特性

Ø 　需氧或兼性厌氧，有些为厌氧菌。营养要求较高。普通培养基中需加有血液、血清、葡萄糖等才能生长。最适温度37℃，最适pH7.4-7.6，血琼脂平板上形成细小露滴状、灰白色、圆而微凸、表面光滑、边缘整齐的菌落；

Ø 不同菌株有不同溶血现象：马腺疫链球菌明显β溶血、化脓链球菌和兽疫链球菌强β溶血、无乳链球菌弱β或α溶血、乳房炎链球菌α或γ溶血、停乳链球菌和肺炎链球菌α溶血。

Ø 血清肉汤培养后，有粘稠或絮状沉淀，上液清朗。

3、生化反应

Ø 发酵简单的糖类，产酸不产气。

Ø 对乳糖、甘露醇、水杨苷等的分解因菌株而异。

Ø 一般不分解菊糖，不被胆盐或1%去氧胆酸钠所溶解。这两种特性可用来鉴别甲型溶血性链球菌和肺炎球菌。

Ø 能使牛奶产酸而不凝固，不液化明胶。

Ø 乙型（ β -）溶血链球菌对杆菌肽敏感。

4、抗原结构 主要有三种：

　（1）核蛋白抗原：或称P抗原，无特异性，各种链球菌均同，与葡萄球菌有交叉。

　（2）多糖抗原：或称C抗原、系统族特异性抗原，是细菌壁的组成成份。

　（3）蛋白质抗原：或称表面抗原，包括抗M、R、T、S等四种不同性质的抗原组份，具有型特异性。是链球菌细胞壁的蛋白质抗原，位于C抗原外层，同族链球菌可根据表面抗原不同进行分型，如A族链球菌可据此分为60多型。

兰氏分群法：兰氏（Lancefield)用温热的稀盐酸浸出C抗原，与特异性血清作沉淀反应，将链球菌分为20个血清群（A-V，缺I和J）。同群链球菌间，因表面蛋白质抗原不同，又分不同型。

5、致病性链球菌可产生的毒素和酶（致病因素）

1）溶血素 2）致热外毒素 3）透明质酸酶

4）链激酶 5）链道酶 6）杀白细胞素

（二）分类

1、根据抗原结构分

Ø 根据链球菌细胞壁中多糖抗原的不同，将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V （即A-H，K-V）等20个血清群，该分类方法称为Lancefield分类法。

2、根据溶血现象分类

⑴ 甲（α）型溶血性链球菌

Ø 菌落周围有不透明溶血环。多为条件性致病菌。

⑵ 乙（β）型溶血性链球菌

Ø 菌落周围形成完全透明的无色的溶血环，致病力强。

⑶ 丙（γ）型链球菌　不产生溶血素，菌落周围无溶血环，也称为不溶血性链球菌。无致病性，常存在于乳类和粪便中，偶尔引起感染。

（三）抵抗力

60℃、30min可杀死大部分链球菌，对一般消毒剂敏感，在干燥尘埃中可存活数日，对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素等均敏感，耐药性低。

（四）致病性与毒力因子

致病因子：可产生多种酶和外毒素。

　（1）M蛋白：是链球菌细胞壁中的蛋白质，具有抗吞噬作用。

Ø 纯化的M蛋白能使纤维蛋白原沉淀，凝集血小板，白细胞，溶解多形核细胞，并抑制毛细血管中细胞的移动。

Ø M蛋白有抗原性，可刺激机体产生型特异性抗体，并与过敏反应有关。

（2）脂磷壁酸（LTA）：

Ø 与细菌粘附于宿主细胞表面有关，多数LAT位于细胞膜和肽聚糖之间，通过肽聚糖孔伸展至细菌细胞表面，人类口腔粘膜和皮肤上皮细胞、血细胞等细胞膜上均有LAT的结合位点。

（3）透明质酸酶（Hyaluronidaes）：

Ø 能分解细胞间质的透明质酸，使病菌易于在组织中扩散。又称为扩散因子。

（4）链激酶(Streptokinase，SK)：又称链球菌溶纤维蛋白酶(Streptococcal fibrinolysin)，是一种激酶，能激活血液中的血浆蛋白酶原，成为血浆蛋白酶，可溶解血块或阻止血浆凝固，有利于细菌在组织中的扩散。耐热，100℃ 50min加热仍保持活性。链激酶抗体能中和该酶的活性。

　（5）链道酶（Streptodonase）：又名脱氧核糖核酸酶(Streptococcal deoxyribonuclease)。主要由A、C、G群链球菌产生。此酶能分解粘稠脓液中具有高度粘性的DNA，使脓汁稀薄易于扩散。产生的相应抗体有中和该酶的活性。用链道酶制剂进行皮肤试验可作为测定机体细胞免疫的一种方法。

（6）链球菌溶血素（Streptolysin）：溶解红细胞，杀死白细胞及毒害心脏，主要有“O”和“S”两种。

　　① 链球菌溶血素O（Streptolysin O，SLO）：为含-SH基的蛋白质，对氧敏感，遇氧时一SH基即被氧化为-SS-基，暂时失去溶血能力。溶血素O能破坏白细胞和血小板。对动物心脏有急性毒害作用。

　　② 溶血素“S”（Streptolysin S，SLS）：是一种小分子的糖肽，无抗原性。对氧稳定，对热和酸敏感。血平板所见透明溶血由“S”引起，能破坏白细胞和血小板，给动物静注可迅速致死。注射小鼠腹腔，引起肾小管坏死。

(7)致热外毒素（Pyrogenic extoxin）：曾称红疹毒素(Erythrotoxin)或猩红热毒素(Scarletfever toxin)是人类猩红热的主要致病物质，为外毒素，使病人产生红疹。 该毒素是蛋白质，对热稳定，具有抗原性，产生的抗毒素能中和该毒素的活性。可分为A、B、C三种不同抗原性的毒素，无交叉保护作用。

(五) 流行病学

（1）化脓性炎症：由皮肤伤口侵入，引起皮肤及皮下组织化脓性炎，如疖痈、蜂窝组织炎、丹毒、乳房炎等。沿淋巴管扩张，引起淋巴管炎，淋巴腺炎，败血症等，经呼吸道侵入，常有急性扁桃腺炎、咽峡炎，并蔓延周围引起脓肿、中耳炎、乳突炎、气管炎、肺炎等。

（2）败血症：猪链球菌病的病原至少有三种：马链球菌兽疫亚种、猪链球菌2型、猪链球菌1型。

（3）猩红热：由产生致热外毒素的A族链球菌所致的急性呼吸道传染病，临床特征为发热、咽峡炎、全身弥漫性皮疹和疹退后的明显脱屑。

（4）变态反应

① 风湿热：由A族链球菌的多种型别引起，临床表现以关节炎、以肌炎为主。

② 急性肾小球肾炎：见于人类，大多数由A族12型链球菌引起。临床表现为蛋白尿、浮肿和高血压。

（5）其他疾病 :B族链球菌又称无乳链球菌(Streptococus agalactiae)当机体免疫功能低下时，可引起皮肤感染、心内膜炎、产后感染、新生儿败血症和新生儿脑膜炎。

所致疾病小结

（六）微生物学诊断

n 标本的采集：采集适当的标本—渗出液、脓汁、乳腺炎

乳液、脑脊髓液、尿液和感染组织。

n 检验方法

1、直接检查：可直接涂片，革兰氏染色镜检。

2、分离培养：接种血平板，观察菌落形态和溶血情况。

3、细菌鉴定：菌落形态、溶血特性、细菌形态、生化特性。如定群、定型，则要作血清学试验。

4、血清学试验

　（1）可使用特异性血清，对所分离的链球菌进行血清学分群和分型。

　（2）抗链球菌溶血素O试验（Anti-streptolysin O test, ASO test），简称抗O试验。常用于风湿热的辅助诊断。患者血清中的抗O大多在250单位左右，活动者一般超过400单位。

（七）微生物检验

1、检验程序

液体检样

• 固体检样→样品处理→增菌培养→分离培养→纯化培养→生化鉴定→报告结果

2、检验操作要点

1）采样：食品：按常规 人体：咽拭 、血、尿

2）增菌培养： 葡萄糖肉浸液肉汤 一般情况 36±1℃ 24h

匹克氏肉汤：在污染严重时用

3）分离培养：血平板， 37℃ 24h,菌落:灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有透明溶血环

4）分纯培养：血平板 37℃ 24h

5）镜检：革兰氏染色，阳性，G+链状排列，符合者可做生化鉴定。

6）生化鉴定:

①链激酶试验（溶纤维蛋白酶试验）

Ø 吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入链球菌18-24h36℃肉浸液肉汤培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL，混匀，置于36℃水浴10min,血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。

Ø 同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。

②杆菌肽敏感试验 :将纯化的乙型溶血性链球菌接种血平板，在划线处贴附杆菌肽纸片，37℃18h，出现抑菌带为阳性，（可推测为乙型溶血性链球菌）

7) 报告结果:根据培养后的形态，菌落特征及生化试验可报告：有乙型溶血性链球菌生长。

第四节 弧菌和气单胞菌的检验

一、弧菌属（Vibrio pacini, 1854）

1、菌体大小与形态:G-，菌体短小，直或弯杆菌（0.5-0.8μm ×1.4-2.6μm），以1根或几根极生鞭毛运动，无荚膜，无芽孢。

2、培养特性与代谢特征:多数在普通培养基上生长良好；兼性厌氧，具呼吸和发酵两种代谢类型。所有的种可在25℃生长，多数在30℃生长。pH值6.0-9.0。Na+刺激所有种生长，并且为多数种所必需。

氧化酶阳性。不产色或产黄色。可代谢D-葡萄糖和其他碳水化合物，产酸不产气。还原硝酸盐(产气弧菌、梅氏弧菌和病海鱼弧菌除外)。多数种发酵麦芽糖、甘露糖和海藻糖。多数对弧菌抑制剂O/129敏感。

2、 生态特性:发现于各种盐度的水生生境，最常见于海、海岸、海面和海生动物的消化道，有的在淡水中也有发现。有的是人病原菌，有的对海洋脊椎和无脊椎动物致病。 最重要的人病原菌：霍乱弧菌（V.cholerea）可引起霍乱；副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）污染过的鱼和贝类引起人食物中毒；创伤弧菌（V.vulnificus）可引起高致死性的败血症。

弧菌检验方法：

（一）霍乱弧菌 (V. cholerae)

分型：

霍乱弧菌血清学分型

生物学性状：

革兰阴性 弯曲弧形或逗点状，首尾相接鱼群样平行排列

单端极鞭毛，有普通菌毛和性菌毛

悬滴观察：细菌运动，非常活泼，呈穿梭样或流星状。

培养特性：

霍乱弧菌检验方法：

鉴别试验;霍乱红试验、粘丝试验、O/129敏感试验、鸡红细胞凝集试验、多粘菌素B敏感试验、噬菌体裂解试验、耐盐培养试验

霍乱红试验：

粘丝试验：

、O/129敏感试验

鸡红细胞凝集试验

多粘菌素B敏感试验

噬菌体裂解试验

V-P试验

耐盐试验

（二）副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）

Ø 具嗜盐性，为海产鱼弧菌病的病原菌，一般在20-28℃引起鱼发病。

Ø 人类食用或接触污染本菌的鱼、器具类等引致食物中毒。

1、形态特征

培养特性：系革兰阴性菌 呈弧状、杆状、丝状等形态。菌体一端有单鞭毛、运动活泼、无荚膜、无芽孢

2、培养特性

• 兼性厌氧,菌落中等大小，培养24h时直径约2mm。

• 最适生长温度是30-37℃，42℃仍可生长。生长pH 5.6-9.6(8.0)。

• 代时10-20 min，增殖速度是大肠杆菌和志贺氏菌的2倍。

• 多数菌株对弧菌抑制剂O/129不敏感，是弧菌属中少有的例外。

• 生长繁殖时必须有钠离子。在含2.5% NaCl培养基上生长良好，不含NaCl的培养基不能生长，具嗜盐性。

培养特征：

• 绵羊血平板不溶血， TCBS琼脂上的菌落发绿, 利用甘露醇。

临床意义：

鉴定依据：

3、 致病性与毒力因子

致病菌株多数能裂解人、兔等红细胞，可用溶血反应区分致病与非致病株，称为神奈川(Kanagawa)试验。

溶血性菌株：产生耐热直接溶血素(Thermostable Direct Haemolysin, TDH)，属穿孔毒素，为不含糖或脂的蛋白质，MW32-44kD，与霍乱弧菌非01群及拟态弧菌产生的TDH相似。

在神奈川试验阴性的菌株中，还发现一种不耐热的毒素磷酸脂酶A2，是本菌的毒力因子。人食用本菌污染的海鱼、贝类等常引致食物中毒，潜伏期2-36h，表现为水样腹泻、呕吐及发热，一般能很快康复。

4、微生物学诊断

Ø 取病变组织接种嗜盐菌选择培养基或SS平板。挑取可疑菌落进一步作生化试验，神奈川试验检测其毒素，也可用PCR技术检测毒素基因。

Ø 由副溶血弧菌引起的对虾红腿病，可取病变组织50g，剪碎后加入50ml灭菌的氯化钠庆大霉素增菌液，增菌18 h，在液面下无菌吸取3ml菌液放入灭菌的试管，120℃,30min后进行斑点ELISA法快速检测，24 h内可检出结果。

Ø 疾病较严重时不经增菌也可检出。与鳗弧菌、溶藻弧菌等无交叉反应。

二、气单胞菌属 (Aeromonas, Kluyver and van Niel, 1936)

Ø 气单胞菌可分为运动性（motile）或嗜温性（mesophilic）及非运动性或嗜冷性两大类，前者以嗜水气单菌为代表，包括温和、豚鼠、凡隆、舒伯特、简达及易损气单胞菌等，其致病作用无明显区别。

临床意义：气单胞菌为水中常居菌 可引起哺乳动物（如人、鸟类等）和冷血动物（如鲑、鱼、蛇等）的感染 在人类主要引起肠道内感染和肠道外感染

气单胞菌常引起5岁以下儿童和成人的肠道内感染，是夏季腹泻的常见病原菌之一，其主要的致病物质为溶血毒素和细胞毒素等。肠道外感染主要为皮肤和软组织感染，与外伤后伤口接触污染的水有关。

2、形态及培养特性

• G-，从直杆菌到接近球状。单个，成对或短链。

• 通常以一根极生鞭毛运动（固体培养幼龄时具周生鞭毛）。兼性厌氧。

• 具呼吸和发酵两种代谢类型。

• 最适生长温度22-28℃；多数种可在37℃生长，其它种最高生长温度38-41℃，最低0-5℃，pH5.5-9.0。

气单胞菌形态特征：

• 革兰阴性短杆菌，有时呈球状 绝大多数有极端单鞭 动力阳性

• 兼性厌氧 营养要求不高，在普通培养基上可以生长，形成灰白色、光滑、湿润、凸起，2mm大小的菌落，在TCBS培养基上不生长。在0°c-45°c范围内均可以生长，根据生长温度的不同，可分为嗜冷菌（37°c以上不生长）和嗜温菌（10°c-42°c之间生长）两大类。

嗜水和杀鲑气单胞菌与霍乱弧菌一样，存在所谓活的非可培养（viable but nonculturable ,VBNC）状态，实际上是一种休眠状态，其菌体缩小成球状，耐低温及不良环境，常规培养不生长。温度回升且获得生长所需的营养条件时，细菌回复到正常状态，重新具有致病力。

3、生化性状

• 对葡萄糖和其他糖类能产酸，常产气。氧化酶和触酶阳性。通常精氨酸水解酶阳性，鸟氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱氨酶阴性，尿酶阴性。明胶酶和DNA酶皆阳性。还原硝酸盐。

• 多数种能发酵的糖包括麦芽糖、D-半乳糖和海藻糖。

• 对抗菌抑制剂2，4—二氨基—6，7—异丙基喋啶（O/129）不敏感。

种属鉴定：

氧化酶阳性、触酶阳性、硝酸盐还原试验阳性、发酵葡萄糖和其它碳水化合物产酸或产酸产气。

4、致病性及毒力因子

Ø 具有毒力因子的菌株才有致病性。

Ø 其毒力因子有3类：一是胞外产物，如毒素和蛋白酶；二是粘附素，如S蛋白、4型菌毛和外膜蛋白等；三是铁载体。

5、微生物学诊断

血平板、麦康凯平板或TSA培养基等可直接分离气单胞菌。从动物腹泻粪便分离则需采用RS选择培养基。分离菌为革兰氏阴性，氧化酶和触酶阳性。同时可凭O129等其它关键生化指标进行判定。

分离株是否有致病性，则还需检测胞外蛋白酶和溶血素等毒力因子，可用脱脂奶平板和血平板划线培养，或用相应抗体建立的ELISA试剂盒检测。

6 、常见种类

ü 嗜水气单胞菌（A.hydrophila） 杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）

（一）嗜水气单胞菌（A. hydrophila）

1 形态与染色特性

• G-, 两端钝圆、直或略弯的短小杆菌，0.3-1.0×1.0-3.5 µm，多数单个存在，少数双个排列。

• 通常菌体一端有单鞭毛，幼龄培养在菌体四周形成鞭毛，但对数生长期过后，该细胞又呈极生单鞭毛。无荚膜，不形成芽孢。

2 培养特性

(1) 兼性厌氧。在普通琼脂、TSA、麦康凯琼脂、SS琼脂上生长良好，血平板β溶血，TCBS或6% NaCl中不生长，对弧菌抑制剂O/129不敏感，一般不发酵乳糖。

(2) 普通琼脂平板菌落: 直径2-3mm, 圆形、表面光滑、边缘整齐、中央隆起、灰白色、半透明。

(3) 在溴化十六烷基三甲铵琼脂上不生长。在TSA平板28℃培养18-24h，菌落呈淡黄褐色，无水溶性色素。

(4) 最适生长温度28℃，最高38-41℃，一些菌株可在5℃生长，pH 6-11(7.2-7.4)，盐浓度0-4%(0.5%)。

3 生化性状

Ø 水解淀粉和精氨酸、发酵甘露醇、赤藓糖醇、棉子糖、果胶糖：+

Ø 苯丙氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶、MR、V.P、氧化酶、触酶试验：+

4 抵抗力

Ø 水中常见菌，一般夏季较多、冬季减少。是鱼肠道菌群之一。鱼和动物分离株较环境分离株的蛋白质分解能力强。对热抵抗力较差，60-65℃,30min-1h死亡。

Ø 对氯霉素、土霉素、氟苯尼考、链霉素、四环素、磺胺嘧啶，硝基呋喃等具抗性的菌株被筛选。从这些菌株分离到相应可转移抗药性质粒。

5 抗原性

运动性气单胞菌有O、H和K抗原

运动性气单胞菌与杀鲑气单胞菌及其他属细菌也存在共同抗原成分

6 致病性与致病因子

Ø 嗜水气单胞菌对多种鱼、两栖类及爬虫有致病性，可引起鳗鲡赤鳍病、红点病、烂鳃病；鲤鱼和金鱼竖鳞病；鲢鳙鱼打印病；青鱼和草鱼肠炎；青鱼疖疮病；香鱼红口病；甲鱼“红脖子病”；蛙红腿病；蛇败血病和口炎。

Ø 此外，还可导致鱼类败血症。称为运动性气单胞菌败血病。感染人类引致急性胃肠炎，是食品卫生检验对象。

Ø 本菌主要通过肠道感染，鱼体受伤或寄生虫感染时可经皮肤和鳃感染，并与水温、有机质含量，饲养密度等密切相关。水温24-28℃死亡率较高，10℃以下不发病。

致病因子

(1)毒素:包括溶血素及肠致病性毒素。溶血素分α和β2种。

α溶血素能引起家兔注射局部的硬结、毛细血管充血和皮肤坏死，对Hela细胞、绿猴肾细胞、成纤维细胞和Y1肾上腺细胞具有毒性，可致动物败血性肠炎。

β溶血素毒性较强，静注0.4μg即可导致小鼠死亡，引起家兔皮肤坏死。

肠致病性毒素可分为3种，即霍乱样肠毒素、细胞兴奋型肠毒素和细胞毒肠毒素。

(2)蛋白酶: 酪蛋白酶、纤维蛋白酶、胶原酶、葡萄球菌溶解素等,这些均与本菌的毒性有关。

(3)外膜蛋白：与细菌的黏附相关。

7 微生物诊断

细菌分离培养：TSA；

生化试验：一般不分解乳糖，对O/129不敏感；葡萄糖产气，发酵甘露醇、蔗糖，利用阿拉伯糖，水解七叶苷/水杨苷，鸟氨酸脱羧酶阴性。

致病因子：检测胞外蛋白酶、溶血素、外膜蛋白等；

血清学检查：玻片/试管/微量凝集；

动物感染试验。

（二）杀鲑气单胞菌（A. salmonicida

1 形态与染色特性

Ø G-短小杆菌，长度不到宽度的两倍，0.8-1.0×1.0-1.8µm，通常成双、短链或成丛状排列。无鞭毛、无动力、不形成芽孢和荚膜。

2 培养特性

兼性厌氧，生长需精氨酸和蛋氨酸。

普通琼脂上22℃培养48h后，形成圆形、隆起、边缘整齐、半透明、松散菌落。

多数菌株在含酪氨酸和苯丙氨酸的TSA、FA(Furunculosis agar,疖疮病琼脂)上产生水溶性褐色素，但厌氧下不能产生色素。

血琼脂上快速溶血，7天后菌落变成淡绿色。

生长温度5-35℃(22-25℃)，生长pH6-9(7)，盐浓度0-3%

3 生化特性

l 阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、糊精、精氨酸水解：+

l 山梨糖、山梨醇乳糖、棉子糖、纤维二糖：-

l KCN肉汤、7.5% NaCl营养肉汤生长：-

l 氨基甲酰磷酸激酶\脂酶、腺嘌呤3, 2-单磷酸激酶：+

l 脲酶、鸟氨酸脱羧酶（ODC）和连四硫酸盐还原酶：-

4 抵抗力

Ø 本菌在蒸馏水存活4d至2w，灭菌河水28d（20-25℃）、灭菌湿土40d（20-30℃）不死亡。

Ø 强毒株在含有机质淡水中可存活15w，在死鱼肾脏存活28d（4℃）、在海水中10d内死亡。

Ø 对土霉素、四环素、氯霉素、萘啶酸、喹啉酮、噁啉酸等敏感。

Ø 许多抗生素只能抑制其繁殖，不能将其杀灭。

5 抗原性

Ø 杀鲑气单胞菌各亚种间具有共同的O抗原。此外，不产色亚种还具有亚种特有的抗原。 杀鲑气单胞菌与本属的其他种也存在共同抗原成分。

6 致病性与致病因子

致病性：主要感染鲑科鱼类，为鲑科鱼类疖疮病病原。

Ø 细菌通过患病鱼、带菌鱼和污染水水平传播。入侵门户主要是受伤皮肤，也可通过胃肠道和鳃感染。

致病因子

Ø 本菌病因与细胞壁表面的A层(additional cell surface layer; A-layer)和胞外产物(extracellular products; ECPs)有关。

Ø 有毒菌株的细胞壁都有A层，主要由50kD的蛋白质组成，因此又称A蛋白层。A蛋白的氨基酸序列类似于大肠杆菌的K88菌毛和胎儿弯杆菌的微荚膜，可吸附于宿主细胞。此外，还可帮助该菌获取铁离子，避免血液中补体的溶解和吞噬细胞的吞噬。

Ø 有A层的菌体悬浮于盐溶液时往往产生自凝现象。这些菌株可凝集鲑鳟鱼类的红细胞，但不凝集鲤科鱼类和哺乳动物的红细胞。

杀鲑气单胞菌的胞外产物（ECP）至少由25种蛋白构成。包括溶血素、鲑溶解素（salmolysin）、杀白细胞素、细胞性糖蛋白及酪蛋白酶、骨胶原酶等。

7 微生物学检查

（1）涂片镜检 取病鱼的血液、脏器等涂片，革兰氏染色，可见革兰氏阴性的短杆菌。

（2）分离培养 取病鱼肾脏或体表溃疡的病健交界处组织，接种于TSA或FA平板，20-28℃培养，检查有无产褐色素的菌落并进行革兰氏染色。

（3）对苯二胺试验 将1%对苯二胺溶液倾注在上述平板中培养后形成的菌落上，杀鲑气单胞菌形成的菌落在90s内，从褐色变成黑色。

（4）血清学检查 玻片凝集反应、间接血凝、荧光抗体技术常应用于分离菌鉴定和本病的诊断。

进行玻片凝集反应时，预先用超声波对分离菌做短暂处理，可防止自身凝集。

此外，乳胶凝集反应和金黄色葡萄球菌协同凝集试验亦为本病的快速诊断方法。还可采用ELISA诊断方法。

（5）带菌鱼的检测 带菌鱼体中病原菌含量少，用常规方法不易检出。应将其转移到高水温饲养，并注射免疫抑制剂以促进病原菌的繁殖，再按上述方法进行诊断。

第五节 革兰氏阳性产芽孢杆菌

第5.1节 芽胞杆菌属（Bacillus）

一群需氧、能产芽胞的革兰氏阳性大杆菌。共40多种，其中对人畜致病的较少，仅炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)具强烈致病性，侵害草食动物及人，引起动物和人类炭疽病。

类炭疽杆菌(形态与炭疽杆菌相似)是实验室常见的污染菌，偶尔也能致病。

蜡状芽胞杆菌(S. cereus)的某些菌株可产肠毒素，引致食物中毒；其他多为腐生菌，主要存在于土壤、水和灰尘中，如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。

一、炭疽芽胞杆菌（B. anthracis）

该菌俗称炭疽杆菌，人畜共患病原体，在医学和兽医学上都相当重要，是引起人类、各种家畜和野生动物炭疽（Anthrax）的病原 。

（一）形态及染色特征

l G+大杆菌，长而粗大，菌体平直，两端平截。长3.0~8.0µm，宽1.0~1.5µm；无鞭毛。在组织和血液中单在或短链状，培养后形成竹节状长链。

l 该菌在组织或含血液培养基中可形成荚膜。有氧条件下形成芽孢，位于菌体中央，不膨出菌体。无鞭毛。

Ø 体内外培养有较大形态差异：

（1）体内（即病料中，如血液、组织）形态

Ø ① 单在或短链状(一般约2~5个)，似竹节状；

Ø ② 形成荚膜；不形成芽胞；

Ø ③ 相连的菌端平截或微凹，游离端钝圆，本菌属的其他细菌接头钝圆，如蜡状芽胞杆菌。

（2）体外（培养基）形态：

Ø ① 长链状（几十或上百个）；

Ø ② 形成椭圆形芽胞，位于菌体中央或近中央，直径小于菌体；

Ø ③ 普通培养基上不形成荚膜。

（3）炭疽杆菌特征形态：

① 慢性局部炭疽病料: 菌体形态常不典型，呈细长弯曲或捻转的杆状；

② 血琼脂、血清琼脂或碳酸氢钠琼脂上，10~20%CO2条件下可形成荚膜；

③ 病料腐败后，菌体分解，但荚膜抗腐败能力较强，荚膜仍可残留，称为“菌影”。

（二）培养特性

1. 需氧或兼性厌氧，最适生长温度30-37℃，pH7.2-7.6，营养要求不高，普通培养基中生长良好。

强毒株形成灰白色不透明、大而扁平、表面干燥；

无毒或弱毒株形成稍小而隆起、表面较为光滑湿润、边缘比较整齐的光滑型菌落。

2. 血琼脂：一般不溶血，个别菌株轻微溶血；而该属其他成员多有明显溶血；

3. 液体肉汤培养基： 24h呈絮状沉淀生长，上清透明清朗，不形成菌膜和菌环；

4.明胶穿刺培养，呈倒松树状，表面液化呈漏斗状。

5. 在含0.5IU/ml青霉素的培养基中，可形成串珠反应，与其它需氧芽孢杆菌区别。当青霉素加至10IU/mL时，炭疽杆菌生长受抑，不生长或微弱生长，而该属其他细菌一般不被抑制。

串珠反应 ：在含青霉素0.5IU/ml的培养基中，幼龄炭疽杆菌因细胞壁的肽聚糖合成受到抑制，形成原生质体相互连接成串 。

（三）生化特性

生化试验不是炭疽杆菌的主要鉴定项目。可了解以下内容：

分解葡萄糖， V.P阳性，

还原硝酸盐，不产生吲哚、 H2S，H2O2酶阳性。

(四) 抵抗力

1、繁殖体：抵抗力不强，同一般无芽孢杆菌。常用消毒剂均能于短时间内将其杀死。

　2、芽胞体：抵抗力非常强，对热、干燥等具有较强的抵抗力； 室温干燥可存活十年，干燥背光处可存活40年以上。在动物皮毛上能活数年，混入泥土中可存活数年至数十年，每到春夏时期地面长出青草时，可将泥中的芽胞带至地面，牛羊食入而受感染。

3、牧场一旦被芽胞感染，传染性可保持20-30年。煮沸1h或干热140℃3h可杀灭芽孢。炭疽杆菌的芽胞对碘敏感，1:2500碘液10min即可杀死芽胞。

(五) 抗原结构

1. 结构抗原

(1) 荚膜抗原：多肽，仅见于有毒菌株，与毒力和抗吞噬有关。

(2) 菌体抗原：多糖，与细菌毒力无关。性质稳定，加热煮沸甚至高压蒸汽处理，抗原性不被破坏。在病畜皮毛或腐败脏器中经长时间煮沸仍能与特异性抗体反应形成环状沉淀，称为Ascoli 反应。

(3) 芽胞抗原：由芽胞的外膜和皮质组成，具免疫原性。

2. 保护性抗原（PA）

是炭疽毒素（PA、LF、EF）的组成成分之一，具有免疫原性，能刺激机体产生保护性抗体。

（六）致病性

动物吃─→含本菌芽胞的饲料或青草─→肠出芽增殖→血→败血症，脾肿大发黑→炭疽(病程短而急，数日死亡)。

1、易感性

（1）绵羊、牛、鹿最易感——急性败血性，尸僵不全、血凝不良、天然孔出血，臌气；脾急剧肿胀至3~4倍；
（2）马属、骆驼、猪、山羊次之——多为慢性局部感染, 如咽部；
（3）狗、猫及食肉动物抵抗力强——多表现肠炭疽；
（4）禽类通常无易感性；
（5）人类：因侵入途径不同而出现不同症状。

2、毒力因子

（1）荚膜：炭疽杆菌的荚膜能抵抗宿主吞噬细胞的吞噬，有利于在机体内生存、繁殖和扩散。

（2）炭疽毒素：主要由3种成分构成。

　① 水肿因子(edema factor，EF): 脂蛋白
　② 致死因子(lethal factor，LF): 蛋白质
　③ 保护性抗原(protective antigen，PA): 一种辅酶。

此3种成分单独对动物无毒性。前2种成分混合注射家兔或豚鼠皮下可致皮肤水肿；后2种混合注射可致肺部出血水肿，并使豚鼠致死；3种混合注射可出现炭疽典型中毒症状。

炭疽毒素主要是增强微血管的通透性，改变血液循环动力学，血液呈高凝状态，引起DIC和感染性休克。

3、致病类型

可致人畜共患的急性、热性、败血性传染病。所致疾病分皮肤、肺、肠和败血性炭疽四种。
（七）微生物学诊断

1、标本采集

按不同病型采取标本，动物尸体仅能割尾、耳或舌尖。一般常取水泡、脓疱内容物、焦痂、咯痰、粪及血液、脑脊液等。

　检验时必须注意：

　（1）病料镜检时一般有荚膜，如无荚膜则分离培养后接种实验动物再进行形态检查。

　（2）注意与类似的细菌鉴别，如蜡状芽胞杆菌等。

　（3）对疑似炭疽死亡的家畜严禁剖检，因其血液不凝，血溅流地面，血中细菌遇空气即生成芽胞，芽胞在土壤中可存活数十年，造成该地区长期的疫源。如必须检验时，只可取兽耳或尾，密封送检，死兽焚毁或深埋。

2. 细菌学检查

（１）镜检：大杆菌，两端平截，竹节状

（２）分离培养：用普通琼脂或血琼脂

（３）纯培养: 镜检、串珠试验、生化试验

（４）动物试验：将检验材料制成悬液或纯培养物给小鼠注射，24-36h小鼠死于败血症。

3. 血清学检查

抗原检测

（１）Ascoli沉淀反应

将病兽皮革或尸体组织切碎，加水煮沸过滤，取滤液滴加于小管内的免疫血清，室温或37℃放置10min，如见两液接触面出现白色沉淀环即为阳性，表明滤液中有该菌的多糖抗原。此法可对腐败尸体及皮革进行追补诊断，但特异性不高，可出现假阳性。

（２）间接血凝试验 （３）协同凝集试验

（４）串珠荧光抗体检查 （５）琼脂扩散试验

抗体检查：比较恢复期和急性期血清特异性抗体升高情况，确诊或流行病学调查。

二、蜡样芽胞杆菌（B. cereus）

• 在自然界分布广泛,常存在于土壤、灰尘和污水中,植物和许多生、熟食品中常见。

• 蜡样芽孢杆菌在食品上于20℃以上的环境中放置,能迅速繁殖,并产生肠毒素。同时,由于本菌不分解蛋白质,因此,食品在感官上无明显变化,无异味,很容易误食而发生中毒。

（一）形态及染色特征

革兰氏阳性大杆菌，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，多鞭毛，能动力。

不形成荚膜,芽孢成椭圆形,位于菌体中央,芽孢发芽形成菌体后,芽孢衣迅速崩裂。

DNA中的G+C含量为31.7%~40.1%。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛,有动力。

（二）培养特性

1、需氧，最适生长30-32℃。

2、在肉汤中混浊生长，有菌膜或壁环，振摇易乳化。

3、在普通琼脂平板上，菌落灰白色,不透明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。

4、在血琼脂平板上，菌落呈浅灰色，不透明，表面粗糙似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环。

5、在MYP（甘露醇-卵黄多粘菌素）平板上，菌落呈粉红色,具有白色混浊环。

（三）生化特性

1、分解葡萄糖、麦芽糖、淀粉、蔗糖、水杨苷，产酸不产气。

2、不分解乳糖、甘露醇、阿拉伯胶糖、鼠李糖、木糖、肌醇、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖。

3、靛基质试验阳性（+），硫化氢试验为阴性H2S（-），尿素酶阴性（-），V-P试验阳性（+），KCN试验阳性（+），柠檬酸盐及卵磷脂酶阳性（+）。

还原美蓝,紫乳迅速胨化。能24h液化明胶。

(四) 抵抗力

1、耐热；游离芽孢能耐受100℃ 30min,而干热灭菌需120℃ sOmin才能杀死。

2、对抗菌素的敏感性。

（五）致病性

Ø 蜡样芽胞杆菌中毒菌量>107/克；> 106/克时，为危险食品

Ø 引起的食物中毒分两种类型:

①呕吐型。由耐热的肠毒素引起,于进餐1~6h发病,主要是恶心、呕吐,仅有少数有腹泻。

②腹泻型。由不耐热肠毒素引起,进食后发生胃肠炎症状,主要为腹痛、腹泻和里急后重,偶有呕吐和发热。

第5.2节 梭菌属（Clostridium）

• 该属细菌多数严格厌氧，革兰氏染色阳性，形成芽孢，芽孢直径往往比菌体粗，使菌体膨胀成梭状，但并非梭菌属的细菌均为梭状，如破伤风梭菌，芽孢位于菌体顶端，菌体呈鼓槌状。

• 该属细菌能产生多种外毒素和侵袭性酶，致病性强，包括产气荚膜梭菌、腐败梭菌、诺维梭菌、肉毒梭菌和破伤风梭菌等。

一、产气荚膜梭菌（Cl. Perfringens）

Ø 旧名魏氏梭菌，在自然界分布很广。

Ø 一定条件下，可引起多种严重疾患，局部组织出现坏死、水肿、产气。

Ø 是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一，可引起典型的食物中毒暴发。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。

1、形态及染色特征

革兰氏阳性粗大梭菌，3-4×1-1.5µm。单独或成双排列，有时成短链。芽胞卵圆形，宽度不比菌体大，位于中央或末端。

培养时芽胞少见，须在无糖培养基中才能生成芽胞。

在脓汁、坏死组织或感染动物脏器涂片可见明显荚膜，无鞭毛，不能运动。

2、培养特性

Ø 本菌虽属厌氧性细菌,但对厌氧程度的要求并不太严。厌氧程度不如破伤风梭菌要求高。

Ø 在普通培养基上能生长,若加葡萄糖、血液,则生长更好。生长适宜温度为37~47℃,多认为43~47℃为最宜本菌生长温度。繁殖速度极快,在适宜条件下增代时间仅8min,可利用高温快速培养法对本菌进行选择分离,如在45℃下,每培养3~4h传种1次,即可较易获得纯培养。

2、培养特性

(1) 血液琼脂平板: 菌落较大、灰白色、不透明，边缘呈锯齿状，多数菌株有双层溶血环，内环是θ毒素的作用，而外环不完全溶血是a毒素所致。

(2) 疱肉培养基: 肉渣不被消化，有时呈肉红色。

(3) 牛乳培养基: 分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时生成大量气体，将凝固的酪蛋白冲成海棉状碎块。管内气体常将覆盖在液体上的凡士林层向上推挤，这种现象称为“暴烈发酵”，是本菌的特点之一，主要鉴别的指标。

在乳糖、牛奶、卵黄琼脂平板上培养的菌落周围出现乳光浑浊带。

n 血平板上，多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。

3、生化特性

Ø 能分解多种糖类，发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖，产酸产气。

Ø 分解水杨苷不稳定，不发酵甘露糖;

Ø 能液化明胶，还原硝酸盐，产生硫化氢；

Ø 不产生吲哚，不能消化已凝固的蛋白质和血清。

Ø 产生卵磷脂酶(磷酸酶C)分解卵磷脂为磷酰胆碱与非水溶性甘油二酸酯。上述卵黄琼脂平板菌落周围出现的乳光浑浊带即属本反应。

Ø 由于发酵乳糖菌落周围的培养基颜色发生变化(中性红指示剂呈粉红色),不消化牛奶,不分解游离脂肪,菌落周围不出现透明环及虹彩层。

4、致病因子与致病性

Ø 产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染性疾病。

Ø 毒素的毒性虽不如肉毒毒素和破伤风毒素强，但种类多，有12种外毒素(αβγδεηθικλμν)和具有毒性作用的多种侵袭性酶(卵磷脂酶、纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶和DNA酶)，构成强大的侵袭力。

Ø 在各种毒素和酶中，以α毒素最为重要，α毒素是一种卵磷脂酶，能分解卵磷脂，损伤多种细胞的细胞膜，引起溶血、组织坏死，血管内皮细胞损伤，使血管通透性增高，造成水肿。

Ø θ毒素有溶血和破坏白细胞的作用，胶原酶能分解肌肉和皮下的胶原组织，使组织崩解，透明质酸酶能分解细胞间质透明质酸，有利于病变扩散。

Ø 本菌能由消化道或创伤侵入机体内，引起人类和动物的多种疾病，其中最重要的是气性坏疽。

Ø 根据细菌产生外毒素的种类差别，可将产气荚膜梭菌分成A、B、C、D、E、F 6个型：

n A型：人气性坏疽和食物中毒； B型：羔羊痢疾；

n C型：绵羊猝死，人坏死性肠炎 D型：牛肠毒血症；

n E型：犊牛、羔羊肠毒血症。

5、微生物学诊断

(1) 直接涂片镜检：G+大杆菌，并有荚膜;

(2) 分离培养：接种血平板，有双层溶血环;

(3) 纯培养：引起牛奶暴烈发酵;

(4) 动物试验：小鼠、家兔或鸽，出现“泡沫肝”;

(5) 肠毒素检查：取回肠内容物，加适量灭菌生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份不加热，一份加热，分别静脉注射家兔或小鼠。如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至数小时内死亡，而加热组动物不死亡。

二、肉毒梭菌(Cl. botulinum)

Ø 肉毒梭菌是厌氧芽孢杆菌属成员,为严格厌氧菌,是一种腐物寄生菌。

Ø 在自然界中分布广泛,遍布于土壤、江、河、湖、海、沉积物等中,水果、蔬菜、畜、禽、鱼制品中亦可发现,偶尔见于动物粪便中。

Ø 一般认为土壤是肉毒梭菌的主要来源。

Ø 污染食品主要存在于密闭比较好的包装食品中,在厌氧条件下,产生极其强烈的肉毒毒素。

Ø 其毒性作用是目前已知化学毒物和生物毒素中的最为强烈的一种,比氰化钾的毒力还大10000倍。

1. 形态及染色特征

• 厌氧性的杆状菌,形成芽孢,芽孢比繁殖体宽,呈梭状,新鲜培养基的革兰氏染色为阳性,产生剧烈细菌外毒素,即肉毒毒素。

• 肉毒梭菌为多形态细菌,约为4um× 1um的大杆菌,两侧平行,两端钝圆,直杆状或稍弯曲。

• 芽孢为卵圆形,位于次极端,或偶有位于中央,常见很多游离芽孢。

• 菌落半透明, 表面呈颗粒状, 边缘不整齐, 界线不明显, 向外扩散, 呈绒毛网状, 常扩散成菌苔。

2. 生长要求及培养特性

• 发育最适温度为25~35℃ 、最适pH为6.0~8.2。

• 在血平板上,出现与菌落几乎等大或者较大的β溶血环。

• 在乳糖卵黄牛奶平板上,菌落下培养基为乳浊,菌落表面及周围形成彩虹薄层,不分解乳糖。分解蛋白的菌株,菌落周围出现透明环。

3. 生化特性

• 本菌生化特性很不规律。

• 一般能分解葡萄糖、麦芽糖、果糖,产酸,产气。

• 对明胶、凝固蛋白均有分解作用,并引起液化。

• 不形成靛基质,能产生硫化氢。但因型、株不同而异。

• 胆汁中不生长，不发酵葡萄糖，甘露醇，不分解胆汁七叶苷，吲哚和DNA酶试验阳性。

4. 免疫学特性

• 根据神经毒素的抗原性分为 A-G 七个型：

• C型包括C1和C2两个亚型。引起人食物中毒的主要是A、B、E和F型,C2和D型主要对家禽致病,C1型主要引起水禽中毒。

• 各型毒素基因序列有很高的同源性,且与破伤风毒素基因也有较高的同源性,但其同源程度有一定的差异。各型之间抗原性不同,其毒性只能被相应的抗毒素所中和。

Ø 按其生理特征还可以分为3个群:

• I 群为蛋白质解性, 能水解凝固蛋白质, 其菌株培养最适温度为35℃ , 包括A、B和F型;

• Ⅱ群为非蛋白质解性, 不能水解凝固蛋白质, 其菌株培养最适温度为26℃ , 包括E、B和F型;

• Ⅲ群包括C和D型, 也为非蛋白质解性。

5. 抵抗力

• 肉毒梭菌的抵抗力一般, 所有菌株在45℃ 以上都受到抑制, 加热80℃ 20min~30min 或 100℃ 10min可将其杀死。

• 芽孢的抵抗力很强, 可耐煮沸1~6h, 于180℃ 干热5~15min, 或121℃ 高压蒸汽10~20min, 或100℃ 5h才能杀死芽孢, 10%盐酸须经1h才能破坏, 在酒精中能存活2个月。以A、B型菌的芽孢抵抗力最强。

• 肉毒毒素虽然是蛋白质,但抵抗力也很强,80℃ 30min或100℃ 10min 才能完全将其破坏。

• 正常胃液和消化酶于24h不能将其破坏,可被胃肠道吸收而中毒。

• 蛋白分解性的肉毒梭菌芽孢比非蛋白分解性的肉毒梭菌芽孢对热具有更强的抵抗力,如A型菌芽孢加热100℃ 360min或120℃ 4min方可被灭活,而E型菌80℃ 20min才能被杀灭。

6. 检验方法

肉毒梭菌的检验以检测肉毒毒素为重点,肉毒梭菌菌体的检查一般意义不大。

• 检验方法：前增菌、分离培养、毒素鉴定

• 最终要根据产毒试验来鉴定细菌及其型别

• 目前肉毒梭菌及肉毒素的检验多采用国标法(GB/T4789.12)。

三、破伤风梭菌（Cl.tetani）

Ø 破伤风梭菌大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，是引起人畜破伤风的病原,经伤口感染引起疾病。

Ø 具有芽孢，其芽孢广泛存在于各类土壤中。本病以骨骼肌发生强直性痉挛的症状为特征，此菌也称为强直梭菌。

多自头部肌肉开始痉挛,两耳竖立,鼻孔张大,粘膜外露,头颈伸直,牙关紧闭,腰背伸直,腹部肌肉紧缩,尾根翘起,四肢强直,状如木马,运行极度困难。

1、形态学特性

Ø 破伤风梭菌菌体细长，长4-8µm，宽0.3-0.5µm ，周身鞭毛，芽胞呈圆形，在动物体内外均能形成，位于菌体顶端，直径比菌体宽大，似鼓槌状，是本菌形态上的特征。繁殖体为革兰氏阳性，形成芽胞的菌体易转为革兰氏阴性。

2、培养特性

Ø 破伤风梭菌专性厌氧，最适生长温度为37℃、pH7.0～7.5；

Ø 普通琼脂平板：24-48h形成直径1mm 以上的不规则菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状，易在培养基表面迁徒扩散;

Ø 血液琼脂平板：明显溶血环；

Ø 疱肉培养基：肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇（有腐败臭味）及硫化氢。

3、生化特性与抵抗力

Ø 生化特性：

　一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，形成吲哚，不能还原硝酸盐。对蛋白质有微弱消化作用。

Ø 抵抗力

　 本菌繁殖体抵抗力与其他细菌相似，但芽胞抵抗力强大。在土壤中可存活数十年，能耐煮沸40-50min。对青霉素敏感，磺胺类有抑菌作用。

4、致病性

Ø 破伤风梭菌芽胞广泛分布于自然界中；自然条件下，其易感性为：马＞猪、牛、羊、犬，人也易感，禽类及变温动物不易感。此菌产生两种毒素

Ø 破伤风痉挛毒素：引起神经兴奋性异常增高和骨骼肌痉挛。是一种神经毒素，为蛋白质，由十余种氨基酸组成，不耐热，分子量15万，可被肠道蛋白酶破坏，故口服毒素不起作用。破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素。

Ø 破伤风溶血素：不耐热，对氧敏感，可溶解马及家兔的红细胞，与致病性无关。

5、微生物学诊断

Ø 取创伤渗出物或坏死组织镜检，或加热80℃经20min以杀死无芽胞杂菌，接种血液琼脂培养基或疱肉培养基中，在厌氧条件下培养24-48小时，挑选可疑菌落进行鉴定，也可取培养滤液0.1毫升接种小白鼠，作毒力和毒力保护试验。

6、免疫防治

Ø 破伤风一旦发病，治疗困难，应以预防为主。

　（1）紧急预防：如遇严重污染创伤者，除用类毒素加强免疫外，可再注射破伤风抗毒素（Tetanus antitoxin,TAT）。即在一臂注射抗毒素，另一臂注射类毒素，6-12周后再注射类毒素。

　（2）特异治疗：一旦发现病人或病畜，应立即注射破伤风抗毒素，要早期足量，每次可肌肉或静脉注射6-10万单位，注射前必须作皮肤试验，防止抗毒素血清过敏性休克的发生。

　（3）大剂量的青毒素（或四环毒）能有效地抑制破伤风梭菌在局部病灶中繁殖，并且对混合感染的其他细菌也有作用，故亦可用于治疗。

　（4）若已确诊为破伤风时，应及时采取给予适当的镇静剂和肌肉解痉剂等措施，以预防因呼吸肌痉挛而窒息死亡。

第六节 革兰氏阳性无芽孢杆菌

李氏杆菌属（Listeria）

• 产单核细胞李氏杆菌(L. monocytogenes)

• 伊氏李氏杆菌(L.ivanovii)

• 无害李氏杆菌(L.innocua)

• 威斯梅尔氏李氏杆菌(L.Welshimeri)

• 西里杰氏李氏杆菌(L.seeligeri)

• 该属代表种是产单核细胞李氏杆菌，引致人和动物的李氏杆菌病。

流行病学

• 分布：广泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、废水、青储饲料、动植物及其食品中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。

• 寄主范围：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳类和昆虫。

一、形态与染色

Ø 短小杆状 , 革兰氏染色阳性。

Ø 不形成荚膜、无芽胞，有鞭毛，20-25℃培养可产生4根周鞭毛，37℃至少可产生1根鞭毛。

Ø R型菌多为长丝状。

在较老的或生长不良的培养物中，可能形成丝状

二、培养特性

• 1、需氧或兼性厌氧，营养要求不高；对NaCl 耐受力很强(18%)；

• 2、 1℃-45℃均可生长，30℃-37℃ 最适， 4 ℃需7天可生长 ——故称“冰箱菌”；

• 3、普通琼脂平板：光滑型、蓝绿色光泽菌落；

• 4、麦康凯上不生长。

• 5、血液葡萄糖琼脂：圆形、光滑、淡蓝色、透明、露滴状菌落，狭窄β溶血；

• 6、半固体培养基穿刺: 沿穿刺线呈云雾状生长。

三、生化特性

1、可分解多种糖：

Ø 能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨苷、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖；

Ø 不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。

2、接触酶、MR、V-P试验：＋

3、 H2S、靛基质、尿素酶、硝酸盐还原、明胶液化、赖氨酸、鸟氨酸：－

4、石蕊牛乳在在24h微产酸，但不凝固。

血清型

Ø 具有O抗原（阿拉伯数字表示）及H抗原 （小写英文字母表示）, 13个血清型，常见1a、2a、1b型。

Ø 与多种细菌存在共同抗原，故血清学诊断意义不大。

四、抵抗力

1 耐碱不耐酸，耐盐。在土壤、牛奶、青贮饲料和粪便中长期存活；

2 对热的耐受性较多数无芽孢杆菌强，常规巴氏消毒法不能杀死该菌，在70℃ 5-10min可被杀死；

3 对消毒剂的抵抗力不强，常用消毒药5-10min能杀死本菌：2.5%石炭酸、70%乙醇、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林均可有效杀灭。

五、致病性

1、本菌细胞内寄生，不被宿主细胞吞噬而破坏。产生的李斯特溶血素O（listeriolysin O, LLO）与其能在巨噬细胞内生长有关。

2、可自然感染多种家畜：猪、马、牛、绵羊；

3、病畜神经症状，成年牛、羊往往表现为“转圈病” ；

4、妊畜流产、血液中单核细胞增多。

5、鸡可全身感染，心肌坏死。

6、成人脑膜炎，新生儿脑膜炎(10%)。

六、微生物学诊断

1. 镜检：肝、脾、脑组织等涂片、革兰氏染色镜检可见G＋呈Ｖ字排列的小杆菌。

2. 分离培养：普通琼脂平板蓝绿光泽的菌落，接种血液葡萄糖琼脂，露滴状菌落，β溶血。

3. 纯培养：溶血检查、运动性检查、生化鉴定。

4. 动物试验 ：病料接种家兔或豚鼠眼内，1d后发生结膜炎，不久败血症死亡；小鼠腹腔注射，剖检肝脏坏死，分离细菌；妊娠2w的动物接种后可发生流产。

5. 血清学检查 ：凝集反应。

七、检测程序
—⑴ 增菌

Ø 目前常用的单核增生李斯特氏菌检测增菌肉汤主要有半量Fraser肉汤、 Fraser肉汤（FB）、UVM（Modified University of Vermont broth，也叫UVM1）、LEB（Listeria enrichment broth）和BLEB（buffered Listeria enrichment broth）

半量Fraser肉汤和Fraser肉汤

• 具有选择性和区别性。

• 加入柠檬酸铁铵和七叶苷，起到区别的作用。李斯特氏菌可以水解七叶苷，与培养基中的铁离子反应，使培养基变黑，可直观的从培养液的颜色就可以判断是否有单核李斯特氏菌的生长。

• 氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。

• 半量Fraser肉汤与Fraser肉汤所用的添加剂一样

• 半量Fraser肉汤：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黄12.5mg/L；Fraser肉汤：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黄的25mg/L

UVM

• UVM只有选择性没有区别性

• 加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄，作为选择性因子。虽然其中含有七叶苷，但是没有添加柠檬酸铁铵，不能发生黑色的颜色反应。

LEB和BLEB

• 只有选择性没有区别性

• LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不含七叶苷和柠檬酸铁铵，无颜色反应。

• BLEB是在LEB基础上加入缓冲体系：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠

检测程序—⑵分离

• 分离培养基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首选仍然是OXA。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培养基中的七叶苷，产生七叶素，与铁离子产生颜色反应而，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反应

• 还有一些选择性显色培养基，如BCM、ALOA、CHROMagar listeria、Rapid’L. mono等，其原理主要是检测由毒力基因编码的溶血素，而此种溶血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的将此两种菌同李斯特属的其他种分开。

检测程序—⑶鉴定

蓝色菌落检验（Henry illumination）

典型运动：相差显微镜，轻微旋转或翻跟头

动力试验：7天，伞形生长

过氧化氢酶试验：阳性

革兰氏染色：阳性短杆菌

溶血试验：穿刺接种血平板

硝酸盐还原试验：5天，阴性

糖发酵试验：葡萄糖、麦芽糖和七叶苷，李斯特菌属反应均为阳性，除格氏李斯特甘露醇阴性，李斯特其他种甘露醇阴性，木糖和鼠李糖最有检测意义。

目前单核细胞增生李斯特菌检验多采用国标法(GB/T4789.30)。

第七节 革兰氏阴性需氧杆菌

一、布氏杆菌属（Brucella）

Ø 布氏杆菌又名布鲁氏菌, 1887年Bruce从死亡士兵脾脏中分到第一株布鲁菌，可引起多种动物发病。

Ø 主要寄居于肝、脾和淋巴组织的单核细胞，是胞内寄生菌。

Ø 布氏杆菌属（Brucella）是一类革兰氏阴性短小杆菌，引起母畜传染性流产。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品均可被感染。

Ø 我国部分地区曾有流行，现基本控制。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。

Ø 我国主要流行羊(Br. Melitensis)、牛(Br. Bovis)、猪(Br. suis)三种。

（一）形态及染色特性

• 1、Gˉ球杆状或细小短杆状；大小0.5-0.7×0.6-1.5μm。多单在，无芽胞、无鞭毛；毒力菌株有菲薄的微荚膜。

• 2、病料或初次分离为球杆状，传代后猪和牛源逐渐变为杆状，而羊源仍呈球杆状。

• 3、常用 柯兹罗夫斯基染色法即柯氏染色法：本菌红色，其他组织细胞与杂菌均呈绿色或兰色。

（二）培养及生化特性

1、专性需氧。牛布氏杆菌初次分离需在5-10% CO2，移种几代后不需要CO2。最适温度37℃，pH6.6-7.2。

2、营养要求高，生长时需硫胺素，烟草酸和生物素，泛酸钙等；普通琼脂上生长贫瘠，加马血清、血液、葡萄糖、甘油、胰化酪蛋白大豆胨等可促进本菌生长。实验室常用肝汤琼脂、马铃薯浸汁琼脂、胰蛋白胨琼脂、改良厚氏培养基分离该菌。

3、液体培养基上呈轻微浑浊，时间长可形成厚菌膜；固体培养基上有S、 R 、I、 M型菌落，大小不一。

固体培养基的菌落特征

• 光滑 (S)型：菌落无色透明、表面光滑湿润、有光泽、透光呈淡黄色及侧光呈现轻微乳色和略带蓝灰色，菌落大小不等，一般直径为05～10mm，小者005～0.1mm，大者3～4mm.

• 粗糙 (R)型：菌落不太透明，呈多颗粒状，表面灰暗，颜色由无光泽白色、淡黄白色或浅黄色到褐色，易碎或黏滞不易从培养基表面刮净。

• 有时还可出现浑浊不透明、黏胶状的黏液(M)型菌落。

• 除S、R和M型菌落外，在培养中还会出现这此菌落间的过渡类型，如S+R型菌落间的中间(I)型菌落。

4、菌落特性

（1）肝汤琼脂或胰蛋白胨琼脂：培养4d，呈细小、柔软、湿润、圆形、隆起、透明和闪光的露滴状菌落，菌落大小不等，小的0.05~0.1mm，大的0.5~1.0mm；

（2）血琼脂：灰白、隆起的细小圆形菌落，不溶血;

（3）麦康凯琼脂上不能生长;

（4）注意：布氏杆菌易发生S-R变异。此菌生长缓慢，48 h后才出现透明小菌落，鸡胚培养也能生长。

5、种和生物型

• 该属现包括6个种20个生物型，

• 即马尔他布氏杆菌生物型1～3、流产布氏杆菌生物型1～9、猪布氏杆菌生物型1～5、绵羊布氏杆菌、沙林鼠布氏杆菌和犬布氏杆菌。

（三）抵抗力

1、自然界中抵抗力较强，阳光直射和干燥条件下抵抗力较弱；在病畜脏器和分泌物中一般能存活4个月，在食品中约能生存2个月。

2、对低温抵抗力强，对湿热敏感， 60℃加热30min或70℃5min即杀死，煮沸立即死亡。 。

3、对链霉素、氯霉素和四环素等均敏感。 对一些消毒剂也很敏感

Ø 对消毒剂的抵抗力也不强，2%石炭酸、来苏儿、烧碱溶液或0.1%的升汞，可于lh内杀死本菌;5%新鲜石灰乳或1%～2%福尔马林3h可将其杀死;0·5%洗必泰或0·01%度米芬、消毒净或新洁尔灭，5min内即可杀死本菌。在pH5或更低情况下迅速死亡。

（四）抗原性及变异性

1、属内抗原：

（1） 细胞壁表面的脂多糖蛋白复合物，包括A（牛布氏杆菌主要成份）和M（羊布氏杆菌主要成份）两种。牛布氏杆菌（Am）含A 抗原多，含M抗原少。羊布氏杆菌(aM)含A 抗原少，含M抗原多。可用凝集吸附试验制备单因子血清，供菌种鉴定用。

　（2）细胞壁内部的脂多糖复合物—R抗原（不凝集S型菌的A、M抗体）；发生S－R变异后，丧失A、M抗原，可暴露R抗原。

绵羊种和犬种布氏杆菌是天然R型种，其他种为S型种。布氏杆菌最常见的变异是S－R变异，很少发生回变。

2、属外抗原：

• 指布氏杆菌能与巴氏杆菌、变形杆菌、弗朗西斯菌、弧菌、弯曲杆菌、钩端螺旋体、假单胞菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌以及大肠杆菌等菌属细菌发生交叉凝集反应的抗原。

（五）致病性

1、致病因子：不产生外毒素，仅有毒性很强的内毒素LPS。

2、感染与致病机理：

① 本菌侵入机体后，被吞噬细胞吞噬，但本菌的荚膜能抵抗吞噬细胞的裂解，并能在该细胞内增殖，成为细胞内寄生菌。

② 繁殖到一定数量后，经淋巴管至局部淋巴结，突破淋巴结屏障而进入血流，反复出现菌血症。由于内毒素作用，病人出现发热、无力等中毒症状，以后本菌随血液侵入脾、肝、骨髓等细胞内寄生，血流中细菌逐步消失，体温也恢复正常。

③ 细菌在细胞内繁殖至一定程度时，再次进入血流，出现菌血症，体温再次上升，反复呈波浪热型。

④因本菌多为细胞内寄生，难于彻底治疗，易转为慢性及反复发作，从而在全身各处引起迁徒性病变。

（六）微生物学诊断

• 布氏杆菌病常表现为慢性或隐性感染，其诊断和检疫主要依靠血清学检查及变态反应检查。细菌学检查仅用于发生流产的动物和其他特殊情况。

本菌传染性大，要注意防止实验室污染。

v 1、细菌学检查

Ø 采样：病料最好用流产胎儿的胃内容物、肺、肝和脾以及流产胎盘和羊水等。也可采用阴道分泌物、乳汁、血液、精液、尿液以及急宰病畜的子宫、乳房、精囊、睾丸、附睾、淋巴结、骨髓和其他有局部病变的器官。

Ø 显微镜检查： 病料直接涂片，作革兰氏和柯兹洛夫斯基染色镜检。若发现革兰氏阴性、鉴别染色为红色的球状杆菌或短小杆菌，即可作出初步的疑似诊断。此法更适合于作流产材料及流产数日月内的阴道分泌物检查。

Ø 分离培养鉴定：急性期采集血液，慢性期采取骨髓，接种于双相肝浸液培养基(一半斜面，一半液体)，置37℃ 10% CO2中培养，每隔2d检查一次，培养30d无细菌可定阴性。

2、变态反应检测

不宜作早期诊断。布氏杆菌水解素注射皮肤，观察红肿反应。1-2cm为弱+；2-3cm为+；4-6cm为强+。

3、血清学检查

可检测血清中布氏杆菌抗体和病料中布氏杆菌。

用已知抗体可检查病料中是否存在布氏杆菌，或分离培养物是否为布氏杆菌，比细菌学检查法简便快速，因而具有较大实用价值。常用方法有荧光抗体技术、反向间接血凝试验、间接炭凝集试验以及免疫酶组化法染色等。

动物在感染布氏杆菌7～15d可出现抗体，检测血清中的抗体是布氏杆菌病诊断和检疫的主要手段。方法多，各有所长，目前还没有一种完美的方法。因此在实际工作中，最好用一种以上的方法相互配合。

v 血清学检查：用已知的布氏杆菌检查动物的血清抗体凝集试验（虎红平板凝集试验）感染初期检测。

大动物血清凝集价达1：100时阳性，1：50可疑；

Ø 小动物1：50为阳性，1：25为可疑。

Ø 补体结合试验：慢性布氏杆菌病诊断。规定1: 10被检血清阻止溶血在50%以上即阳性。

Ø 凝集反应、补体结合反应和变态反应出现的时间各有特点。即动物感染布氏杆菌后，首先出现凝集反应，消失较早;其次出现补体结合反应，消失较晚；最后出现变态反应，保持时间也较长。

Ø 在感染初期阶段，凝集反应常为阳性，补体结合反应或为阳性或为阴性，变态反应则为阴性。到晚期慢性或恢复阶段，则凝集反应与补体结合反应均转为阴性，仅变态反应呈现阳性。因此有人主张，为了彻底消除各类病畜，应同时使用三种方法进行综合诊断。

微生物学检验

二、假单胞菌属（Pseudomonas Migula 1894）

Ø Gˉ ，直或微弯的杆菌，0.5-1.0×1.5-5.0μm。多单在。不产芽孢。以单极或数根极毛运动，有的种还具短波长的侧毛。严格需氧。

Ø 不能在酸性下（pH4.5）生长，多数种不需要有机生长因子。化能异养，有的种利用H2或CO为能源兼性化能自养。接触酶阳性, 产生各种水溶性色素。

Ø 自然界分布极广，土壤、淡海水、污水、动植物体表等均存在。

Ø 引起疾病(Pseudomonas Disease)的有绿脓杆菌、荧光假单胞菌、鳗败血假单胞菌和恶臭假单胞菌等。

（一）铜绿假单胞菌（P. Aeruginosa ）

Ø 原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。易从外伤、烧伤及尿道感染的标本分离。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。

1 形态及染色特征

Ø 铜绿假单胞菌为非发酵革兰氏阴性菌，菌体细长，长短不一， 呈球杆状或线状，成对或短链状排列。

Ø 菌体一端单鞭毛，暗视野或相差显微镜下可见细菌运动活泼。

2 生长特性

Ø 专性需氧，生长温度25~42℃，最适25~30℃，4℃不生长，42℃可生长，可用以鉴别该菌。

Ø 普通培养基上生长18~24h可见扁平、湿润的菌落，能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等，使得培养基呈亮绿色。

Ø 血琼脂平板生长可见菌落周围有溶血环，菌落呈金属光泽；液体培养基呈浑浊状生长，液体表面形成菌膜，培养基底部生长不良。

3 生化特点

该菌氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖、木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖。

Ø 液化明胶、可分解尿素，还原硝酸盐为亚硝酸盐并产生氮气。

Ø 吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性。

4 抗原性与分型

Ø 该菌含O抗原（菌体抗原）及H抗原（鞭毛抗原）。O抗原包含两种成分：一种是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂多糖，有特异性。O抗原可用以分型。

（1）噬菌体分型：所应用的噬菌体现有24株，分型率达90%。

（2）血清学分型：利用O抗原进行分型，目前可分20个血清型。

（3）质粒指纹图分析：此项技术是对同种细菌的不同株进行同源性分析的一种方法。根据细菌携带质粒的情况进行分析。

5 微生物学检查

Ø 标本采集：采自不同感染部位的各种标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自环境中的各种标本如水、空气、物体表面等。

Ø 涂片镜检: 革兰阴性，菌体大小1.5-5.0×0.5-1µm。菌体的一端有单鞭毛，无芽胞。

Ø 分离培养: 对有正常菌群存在的临床标本或采自环境中的标本应接种选择性培养基: 麦康凯琼脂(MAC)； 对无正常菌群存在的临床标本如血液、脑脊液、穿刺液等可接种普通或血琼脂培养基。

（二）椰毒假单胞菌酵米面亚种

Ø 椰毒假单胞菌酵米面亚种（Psedomonas cocovenenans supsp. farino fermentans）是我国发现的一种新的食物中毒菌，它存在于发酵的玉米、糯玉米、黄米、高梁米、变质银耳以及周围环境中，它是酵米面及变质银耳中毒的病原菌。该菌产生的毒素米酵菌酸是其致病原因。

1 形态及染色特征

Ø 革兰氏阴性短杆菌，大小为1.5-4μm×0.5-1.0μm，直或微弯的需氧杆菌。细胞呈卵圆、短杆状以至长杆状形态。两端钝圆，无芽胞，有鞭毛。兼性厌氧，但易在表面生长。

Ø 胞浆中含浓染颗粒及空泡。在透射电镜下观察,可见异染颗粒、脂质颗粒、板层状内膜结构等特殊结构。

Ø 假单胞菌属为有机化能异养菌,代谢为呼吸而非发酵,有些是兼性化能自养菌,能利用H2或CO2为能源。分子氧是普遍的电子受体,有些能脱氮而利用硝酸盐为替代的受体。

Ø 除能利用脱氮作用以厌氧呼吸的一些外,均为严格或专性需氧菌。菌苔虽不明显呈色,但部分菌可产生水溶性色素和荧光色素。

2 生长培养特性

Ø 椰毒假单胞菌的某些菌株在有硝酸盐环境中可呈厌氧生长。

Ø 营养要求不严格,几乎所有菌群在铵盐和单一碳源环境中均可生长。生长温度为25~37℃ ,

Ø 最适生长温度为37℃ ,最适产毒温度为26℃ 。

Ø PDA平板上生长,菌落大小为1~2mm,呈乳白色或灰白色,光滑、湿润、边缘整齐;培养48h后,中心有突起,呈草帽状或放射状花纹;菌落周围有黄绿色素产生,并扩散到基质中。在365nm紫外灯下有黄绿色荧光。

Ø 卵黄琼脂平板上生长,菌落表面光滑、湿润,48h后,菌落周围形成乳白色浑浊环,斜射日光下可见环的表面呈虹彩现象。

Ø S.S琼脂平板不生长。

Ø 以脱脂椰肉为基质,接种椰毒假单胞菌,30℃下培养4d产生的米酵菌酸,可溶于石油醚中,用PHS的水萃取后调pH至2~3,可再用石油醚或乙醚萃取,如此反复可得到较纯净的米酵菌酸。

3 生化特性

Ø 假单胞菌氧化糖类只产生少量的酸。

Ø 蛋白胨糖水不适用于测定酸的产生。因为产生的酸常被蛋白胨分解产生的碱所中和。

Ø 用铵盐培养基易测定酸的产生。因在该培养基中糖是唯一碳源。

Ø 过氧化氢酶阳性。

Ø 假单胞菌能产生和分泌许多胞外酶,包括蛋白酶、脂酶、卵磷脂酶等。

Ø 明胶酶的产生对其分类很重要。

4 抵抗力

Ø 在PDA上生长的椰酵假单胞菌,对金霉素、土霉素、四环素、庆大霉素较为敏感,对青霉素、红霉素、合霉素、氯霉素、新霉素具有很强的抗性。

Ø 椰酵假单胞菌对一般常用的消毒剂都很敏感,但鉴于许多消毒剂本身的毒性和残留问题,仅可用于实验室消毒。

Ø 亚硫酸氢钠对椰酵假单胞菌具有较强的抑菌和杀菌作用,可用于某些食品加工过程的消毒。

5 抗原构造

Ø 椰酵假单胞菌具有O、K、H3种抗原。很少发生交叉反应。

Ø O抗原为菌体抗原,耐热,凝集反应出现较慢,聚集物呈颗粒状。

Ø H抗原为鞭毛抗原,不耐热,凝集反应发生迅速,凝块呈疏松絮状。

Ø K抗原为表面抗原。

Ø 在3种抗原中,研究得最多的是O抗原。迄今已证实该菌具有7种O抗原因子,划分为6种O抗原型。

Ø 椰毒假单胞菌的血清型目前有O-Ⅲ 、O-Ⅳ 、O-Ⅴ 、O-Ⅵ 、O-Ⅶ 、O-Ⅷ 等。

Ø 产毒与血清型有关,已知O-Ⅴ 、O-Ⅳ 、O-Ⅲ 产毒。

6 致病因素

Ø 此菌产生毒黄素和米酵菌酸两种外毒素。以其外毒素引起食物中毒。该外毒素耐热性很强,120℃ 高温处理1h仍保持毒力。

Ø 椰酵假单胞菌食物中毒是该菌的主要代谢产物米酵菌酸引起。它耐热,毒性强,不能被一般的烹调方法所破坏。

7 检验方法

目前椰霉假单胞菌酵米面亚种检验多采用国标法(GB/T4789.29)

第八节 革兰氏阴性微需氧和厌氧菌

• 本类共包括8个属和1个科：1、弯曲菌属，2、水螺菌属，3、螺菌属，4、固氮螺菌属，5、海洋螺菌属，6、蛭弧菌属，7、吸血弧菌属，8、螺杆菌属，以及拟杆菌科。

• 在医学检疫上有意义的是弯曲杆菌和螺杆菌属。

一、 弯曲菌属 Campylobacter

Ø 一类呈逗点状或S形的革兰氏阴性杆菌，广泛分布于动物界，其中有些可引起动物和人类腹泻、胃肠炎和肠道外感染。

Ø 目前弯曲菌属有18个种（含亚种），对人类致病的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌的胎儿亚种，前者引起人类急性腹泻，后者在免疫功能低下时可引起败血症、脑膜炎等，其次是胎儿弯曲菌和大肠弯曲菌等。 1983年分离的幽门弯曲菌则与慢性胃炎和胃溃疡、十二指肠溃疡有关。

Ø 兽医临床上常见的有五个种（含亚种）：空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌（胎儿亚种和性病亚种）、小肠弯曲菌、幽门弯曲菌。其中以空肠弯菌最多见，胎儿亚种次之。

致病性

（一）形态与染色

1、0.2-0.4×1.5-3.0μm； G-, 呈弧形、S形或海鸥展翅状，不易着色；

2、无芽孢，一端或两端各有一根鞭毛，运动活泼，形态似霍乱弧菌；

3、从微需氧到厌氧，CO2有利于其生长。

（二） 培养特性

• 微需氧，最适生长环境: 氧气5％、二氧化碳10％、氮气85％；通常42℃初分离空肠弯和大肠弯曲菌，其他菌株37℃生长良好。

• 营养要求高，普通培养基不生长，常用含头孢哌酮的选择性培养基，以抑制肠道正常菌群。

• 含血的Skirrow培养基、头孢哌酮-万古霉素-两性霉素琼脂培养基（CVA）和不含血的碳-头孢哌酮-去氧胆酸盐（CCDA）、碳基选择性培养基（CSM）和半固体动力培养基等常用于分离该属的细菌。

• 在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。

（四） 抵抗力

• 抵抗力较弱，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，56℃、5min可被杀死。但耐寒，在4℃冰箱或水中可存活4周。

• 对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。但近年发现了不少耐药菌株。

（五）抗原构造

• 本菌抗原构造比较复杂，与肠道杆菌一样具有O、H和K抗原。

• 根据O抗原，可把空肠弯曲菌分成45个以上血清型。

• 目前分型没有被广泛应用。

（六）毒力

• 本菌具有粘附定居和入侵上皮细胞的能力，通过产生的肠毒素、细胞毒素和内毒素等多种毒力因子致病，病变部位通常在空肠和回肠，也可蔓延至结肠。

（七）致病性

可引起人畜急性传染病——弯曲菌病。

1、带菌者：动物和人类，经肠道或生殖道排出；

2、感染：经口(污染的食物或水)；经产道感染婴儿；

3、临床症状：潜伏期1-10d，一般3-5d。

（1）肠炎：腹泻、腹痛、呕吐及发热等，初为水样，继而转为粘液便，少数呈脓血便。

（2）肠道外感染：可致菌血症、心内膜炎、脑脊髓膜炎、血栓性静脉炎、关节炎、肺脓肿和腹膜炎等。

（3）母畜感染：上呼吸道症状、肺炎、发热及菌血症；死胎或流产；新生畜败血症及脑脊髓膜炎。

（八）微生物学诊断

1 粪便直接镜检，G-呈弧形、呈投镖式运动。

2 核酸检测粪便

细菌鉴定

（九） 检验程序

1. 标本采集

采集粪便及剩余食物，立即送检，或将标本接种于卡-布运送培养基中送检；

对于高烧和脑膜炎者，于用药前抽取静脉血或脑脊液，注入布氏肉汤送检。

2. 细菌检验

（1）显微镜检查

①悬滴法动力检查：显微镜下观察有无螺旋状或投标样运动，脑脊液标本经离心沉淀后再制成悬滴标本检查；

②染色标本检查：取新鲜粪便或脑脊液离心沉淀物涂片、革兰氏染色，找革兰氏阴性、弯曲呈S状或螺旋状杆菌，鞭毛染色见一端或两端单根鞭毛；

（2）分离培养 将标本直接接种于选择性培养基上，也可将标本过滤后培养，弯曲菌形成的菌落为灰色、扁平、表面湿润、圆形凸起、边缘不规则，常沿穿刺线蔓延生长，血平板不溶血，布氏肉汤中呈均匀混浊。

3. 细菌鉴定

• 弯曲菌属的鉴定较复杂，必须综合多种试验确定。

• 通常氧化酶阳性、革兰染色阴性、弯曲呈S形或螺旋形，进一步鉴定试验：

①马尿酸盐水解试验：鉴别空肠弯曲菌空肠亚种和多氏亚种的重要试验；前者阳性，后者阴性。

②醋酸吲哚水解试验：空肠弯曲菌为阳性而胎儿弯曲菌为阴性。

③萘啶酸、头孢噻吩耐药试验：

空肠弯曲菌和大肠弯曲菌对萘啶酸敏感，对头孢噻吩耐药；

胎儿弯曲菌对萘啶酸耐药而对头孢噻吩敏感。

近来出现了对萘啶酸耐药的空肠弯曲菌，应结合醋酸吲哚水解试验进行鉴定。

• 空肠弯曲菌检验国标法：GB/T4789.9-2008

弯曲菌属的鉴定

空肠弯曲菌的鉴定

二、 螺杆菌属 Helicobacter

• 螺杆菌属（Hilicobacter）是一群氧化酶和触酶阳性、微需氧、37℃生长、25℃和42℃均生长不良的革兰阴性弯曲菌。

幽门螺杆菌

（一）形态与染色

Ø 革兰氏阴性、无芽孢、呈螺旋状弯曲，杆状，尤其在胃粘膜环境中，幽门螺杆菌具典型螺旋形或弯曲形，但在陈旧培养物中菌体可呈圆球状；

Ø 多数细菌具有位于菌体一端的多根带鞘鞭毛，运动活泼。

（二） 培养特性

• 微需氧，有氧及无氧环境均不生长，潮湿，37℃，5-10％O2、5-12％CO2生长良好，5-10％H2可刺激其生长；最适温度35-37℃，30和42℃均生长不良，此点可与其他弯曲菌区别，生长pH5.5-8.5。

• 普通培养基不生长，需补充血、血清、淀粉、活性炭等。常用心脑浸出液琼脂、布氏琼脂、哥伦比亚琼脂等。

选择性培养基：改良的Skirrow琼脂培养基加入万古霉素、两性霉素和头孢磺啶。

血平板：经3-5d形成小的半透明灰色菌落，有微弱的溶血环，革兰氏染色浅。

（三） 生化反应

• 生化反应不活泼，氧化酶和触酶阳性，不分解任何糖类，脲酶强阳性，可与本属其他细菌区别，也是检测HP的快速诊断方法之一。

（四） 抵抗力

Ø 对酸敏感，尿素可保护该菌，1％胆盐可抑制其生长。

耐药性：对多粘菌素、三甲氧苄氨嘧啶、磺胺、万古霉素和萘啶酸天然耐药。

在体外药敏试验中，该菌对不少抗生素敏感，但体内用药效果不佳，主要因为该菌寄生在粘液层下的胃上皮细胞表面，抗生素不能渗入胃粘膜深层。

临床上治疗该菌的药物有阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、四环素、呋喃唑酮等。

（五） 致病因子与致病性

• 该菌有较强的鞭毛动力，对胃粘膜有较强粘附力，在接近中性的粘膜层定植，产生强活性尿素酶以分解尿素，在菌体周围形成保护性氨环境，以抵抗胃粘膜上皮细胞分泌的胃酸；该菌产生的蛋白酶能有效分解粘液蛋白，提供营养。

• 幽门螺杆菌在胃内定植后，粘附于胃粘膜上皮细胞、通过胃肠激素刺激和细胞壁脂多糖中脂质A的致炎作用、产生多种酶(尿素酶、蛋白酶、过氧化氢酶、脂酶和磷脂酶等)以及细胞毒素，共同作用导致临床疾病的发生。

• 主要引起消化性溃疡（十二指肠溃疡、胃溃疡）、慢性活动性胃窦炎等，长期感染易发展为萎缩性胃炎、胃腺癌和胃粘膜淋巴组织淋巴瘤。

（六）微生物检验

（七） 微生物学诊断

1、 标本采集

Ø 采集胃和十二指肠粘膜新鲜标本，置2ml无菌生理盐水，运输途中不超过3h，4℃不超过5h。

Ø 流行病学调查时可取血清。

2、显微镜检查

• ①直接镜检：取胃、十二指肠粘膜活检标本作革兰染色，在油镜下查找细长弯曲或呈海鸥展翅状排列的菌体；

• ②组织学切片：可行Warthin-Starry银染、改良Giemsa染色、甲苯胺蓝染色、石炭酸复红染色等。

3、分离培养

Ø 5％绵羊血的布氏琼脂或7％马血的心脑浸液分离，用改良的Skirrow琼脂（万古霉素和两性霉素各10mg/L、甲氧苄啶5mg/L）选择性培养，在含5％O2、10％CO2、85％N2的微需氧环境37℃孵育3-5天，长出细小、灰白色、半透明、不溶血的菌落。

4、快速检查

• ①快速脲酶试验：取一小块新鲜活检标本置于含尿素的培养基，由于幽门螺杆菌产生大量的细胞外尿素酶，可分解尿素产大量氨，培养基pH升高，指示剂变色，可在5-30min内检测出幽门螺杆菌；该法简便实用、快速灵敏且较为准确，适合胃镜检查病人；

• ②核素标记试验：敏感性和特异性均很高，但操作稍繁琐；

• ③PCR：是一种高度敏感和特异的方法，目前仅用于实验研究；

• ④抗原检测：可用商品化试剂盒，ELISA法直接检测菌体抗原。

5、鉴定

Ø 主要通过典型菌体形态，生长缓慢，仅于37℃生长。氧化酶和触酶阳性，脲酶强阳性，对萘啶酸耐药，对头孢噻吩敏感，在1％甘油和1％胆盐中均不生长。

第八节 分支杆菌属及相似属

Ø 分支杆菌属是一类细长略带弯曲的杆菌，含有分支菌酸，有分枝生长的趋势而得名。

Ø 具有抗酸性，一般不易着色，经加温或延长时间才能着色，着色后能抵抗盐酸酒精的脱色作用，故又称抗酸杆菌，归属于放线菌科，已鉴定的有70余种。

Ø 放线菌科是一大类微生物，分为8个属，大多数不致病。

Ø 致人畜疾病的放线菌可分含和不含分支菌酸两类。

（1）含分支菌酸的放线菌有：分支杆菌、诺卡菌属

（2）不含分支菌酸的放线菌有：放线菌属，棒状杆菌属

• 麻风分支杆菌，俗称麻风杆菌，引起麻风，是一种慢性传染病。

• 流行广泛，主要分布在亚、非和拉丁美洲

分支杆菌属(Mycobacterium)

Ø 包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌等，其中前三者对人类致病。人型结核分枝杆菌感染的发病率最高。

Ø 此菌属的最显著特性为其胞壁中含有大量类脂，可达菌体干重的40%，形成粗糙菌落，难用一般染料染色。

Ø 若设法使之着色后，又不易以含3%HCl的酒精脱色。这种能抵抗盐酸酒精脱色的细菌称为抗酸杆菌。

Ø 本菌属种类颇多，其中可引起人类和动物疾病的有:（1）人型、牛型以及禽结核杆菌;（2）麻风杆菌。这些细菌多为慢性感染，因长期迁延而致组织病变。

Ø 分支杆菌属主要有3种：结核分支杆菌(M.tuberculosis)、牛分支杆菌(M.bovis)、禽分支杆菌(M.avium)，是引起人类以及畜禽结核病的病原体。这里只介绍结核分支杆菌。

一 、结核分支杆菌（M.tuberculosis）

1、形态与染色特性

Ø 细长略弯, 端钝园, 0.4×1-4µm，单个或分枝状排列，无荚膜、无鞭毛、无芽胞。

Ø 在陈旧的病灶和培养物中形态不典型，呈颗粒，串球，短棒，长丝形等。

Ø 结核杆菌常用萎-钠氏(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法染色，菌染成红色，其他非抗酸细菌及细胞等呈蓝色。

2、培养特性

Ø 专性需氧。营养要求高，在含蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长。最适pH6.5-6.8，最适温度37℃，生长缓慢，接种后培养3-4周才出现肉眼可见菌落。

Ø 菌落干燥、坚硬、表面颗粒状、乳酪色或黄色，形似菜花。液体培养呈粗糙皱纹状菌膜，加入水溶性脂肪酸Tween-80，可降低结核杆菌表面的疏水性，使其呈均匀分散生长，有利于药物敏感试验。

3、抵抗力

Ø 结核杆菌对某些理化因子抵抗力较强。在干痰中存活6-8个月；

粘附于尘埃上，保持传染性8-10d；

在3%HCl或NaOH溶液中耐受30min，常以酸或碱处理污染的样品，以杀死杂菌，提高检出率； 对湿热、紫外线、酒精抵抗力弱: 液体加热62-63℃ 15min，日光直射2-3h，75%酒精数分钟即死亡。

4、变异性

Ø 对链霉素、利福平、异烟肼等抗结核药物易产生耐药性。耐药菌株常伴随活力和毒力减弱，如异烟肼耐药菌株对豚鼠的毒力消失，但对人仍有一定致病性。

Ø 卡-介（Calmette-Gerine）二氏将牛型结核杆菌培养于胆汁、甘油、马铃薯培养基，经230次传代，历时13年，其毒力发生变异，成为对人无致病性，而仍保持良好免疫性的菌株，称为卡介菌(Bacilli Calmette-Giierin, BCG)，接种人体后可获得对该菌的免疫力。

5、致病因子

结核分支杆菌无内毒素、外毒素和侵袭性酶，其致病作用主要靠菌体成份，特别是胞壁中所含的大量脂质。脂质含量与结核杆菌的毒力相关，含量愈高毒力愈强。

1、脂质（Lipide）

占菌体干重20-40%，胞壁干重的60%，主要是磷脂、脂肪酸和蜡质，大多与蛋白质或多糖结合成复合物。

① 磷脂：刺激单核细胞增生，抑制蛋白酶的分解作用，使病灶组织溶解不完全，形成干酪样坏死。

② 脂肪酸：在脂质中比重较大，其中6, 6-二分枝酰-a,a’-海澡糖(6,6-Dimycocyl-a,a’-D-trehalose)能破坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞游走和吞噬，引起慢性肉芽肿。具有该物质的结核杆菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状，称为索状因子(cordfactor)。

③ 蜡质D：为胞壁主要成分，是一种肽糖脂 (Piptidoglycolipids) 与分枝菌酸(My-colic acid)的复合物，能引起迟发型变态反应，并具有佐剂作用。

④ 硫酸脑苷脂(salfatides)和硫酸多酰基化海澡糖(Multiasiylated trehalose salfate)：存在于结核杆菌毒株胞壁，能抑制吞噬细胞中的吞噬小体与溶酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。这类糖脂能结合中性红染料。产生中性红反应，借此可鉴定结核杆菌的毒力。

2、蛋白质（Protein）

Ø 　结核杆菌菌体内含数种蛋白质，重要的是结核菌素(tuberculin)，其与蜡质D结合后，能引起较强的迟发型变态反应。蛋白质具免疫原性，但无保护作用。

3、多糖（Polysuccharides）

Ø 　多糖常与脂质结合存在于胞壁中，主要有半乳糖，甘露醇、阿拉拍糖等。多糖可使中性粒细胞增多，引起病灶局部细胞浸润。

4、核酸 (Nucleic acid)

Ø 　核糖体核糖核酸(Ribonucleie acid ribosonic, rRNA)是本菌的免疫原，刺激机体产生特异性细胞免疫。

6、致病性

• 结核杆菌的致病作用可能是细菌在组织细胞内顽强增殖引起的炎症反应，以及诱导机体产生的迟发型变态反应有关。

• 结核杆菌可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官的结核病，其中以肺结核最常见。动物则常见内脏（如肠道等）结核。

7、免疫性

Ø 　 结核分支杆菌的免疫原rRNA和变应原结核菌素可诱发机体产生由T淋巴细胞介导的细胞免疫和迟发型变态反应。

Ø 　 人类及动物对结核杆菌的感染率很高，但发病率却较低，这表明机体感染结核杆菌可获得一定免疫力，其持久性依赖于结核杆菌在机体内的活性，一旦体内结核杆菌消失，抗结核免疫力也随之消失，这种免疫称为有菌免疫或传染性免疫(Infection immunify)。

8、微生物诊断

（1）采样

Ø 肺炎结核最好取早晨第一次咯痰；肾或膀胱结核以无菌导尿；肠结核采粪便，结核性脑膜炎取脑脊液；胸膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺取脓汁。 　

（2）涂片染色

咯痰可直接涂片。

用抗酸染色法，若镜检找到抗酸性杆菌，可能是结核杆菌，单凭形态染色不能确定是结核杆菌，需进一步分离培养鉴定。

标本中结核杆菌量少时应浓缩集菌后再涂片染色镜检，以提高阳性检出率。

无菌直接采取的脑脊液和导尿可直接离心集菌。咯痰和粪便标本需用4%NaOH或3%HCl或6%H2SO4处理，然后用离心沉淀集菌作抗酸染色检查、分离培养或动物试验。

（3）分离培养

• 结核分支杆菌生长缓慢，培养期长，当接种于固体培养基上（如青霉素血液琼脂），以蜡封口防止干燥。37℃培养4-6周后检查，该菌生长缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色，菜花状。

• 脑脊液、胸腹水等无杂菌污染的标本可直接或离心后取沉渣接种等有杂菌污染的标本在接种到培养基之前须做适当的处理，以消除杂菌的干扰。

• 标本接种于选择性固体培养基中，常用罗琴培养基，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长：37℃，5％—10％CO2培养8周，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，多数是结核分枝杆菌。阴性继续培养至12周方可报告

（4）动物试验

• 常用豚鼠或地鼠鉴别疑似结核杆菌的分离培养物和其毒力。

• 取浓缩集菌标本1ml注射于豚鼠腹股沟皮下，经3-4周饲养观察，如出现局部淋巴结肿大，消瘦或结核菌素试验阳性，可及时剖检，注意观察淋巴结、肝、脾、肺等脏器有无结核病变。

（5）变态反应

• 我国常用皮内法和点眼法，皮内法4mm以上为阳性；2-4mm为可疑；2mm以下为阴性。 可检出95~98%的结核病牛。

（6）核酸检测

• 用PCR法快速诊断结核分枝杆菌感染。

• 设计特异rRNA片段进行扩增，然后用特异的DNA探针与之杂交。

• 特异性与敏感性均大于95％。

（7）抗PPDIgG的检测

Ø 用ELISA法检测患者血清中抗PPDIgG，可作为活动性结核分枝杆菌感染的快速诊断方法，阳性率为80％～90％。

（8）鉴定

Ø 菌种鉴定可为结核病和非典型分枝杆菌病的临床鉴别和防治提供科学的依据。

(1)PCR反向膜探针杂交EHSA法(PCR杂交梳)：

Ø 该法是将PCR、分子杂交、酶联免疫显色技术有机结合，经过两次特异性双向选择，其特异性相互补充和加强，对提高方法的特异性，消除假阳性起决定作用。

(2)DNA探针：

Ø 使用对分枝杆菌rRNA序列特异的DNA探针与分枝杆菌rRNA杂交，由于每个分枝杆菌细胞内有10，000个rRNA拷贝，故为杂交提供了放大系统，提高了灵敏度，将荧光素或同位素标记在探针上，可鉴定菌种。

（3)16s rRNA基因序列测定：

Ø 由于不同种的分枝杆菌其16srRNA基因序列是不同的，所以可通过测定16s rRNA基因序列鉴定菌种。

(4)高效液相色谱(HPLC)检测：

Ø 由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种。

（9）结核菌素试验

Ø (1)原理：旧结核菌素(OT)，主要成分是结核分枝杆菌蛋白。将其稀释10000倍，使每0．1ml含1u。纯蛋白衍生物(PPD)，是用三氯醋酸沉淀结核菌培养滤液后的纯化物。每0.00002mg为1U，注入皮内后如受试者已感染结核，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，形成迟发型超敏反应性炎症。

Ø (2)方法：取5UPPD或OT0.1ml注射于前臂掌侧皮下，经48—72h。注意局部有无硬结，不能单独以红晕为标准。

(3)结果分析：

Ø ①阳性注射部位硬结、红肿直径0.5—1.5cm之间。这表明机体曾感染过结核，出现超敏反应，但不表示正患结核病；

Ø ②强阳性 硬结直径超过1.5cm以上，表明可能有活动性结核，应进一步检查；

Ø ③阴性 注射部位有针眼大的红点或稍有红肿，硬结直径小于0.5cm，说明无结核感染，但应考虑下述情况：如受试者处于原发感染的早期，或正患有其他传染病

(4)应用：

①选择BCG接种对象及测定接种效果，结核菌素反应阴性者应接种BCG；

②结核菌素试验对婴幼儿可做诊断结核病之用；

③在末接种BCG的人群中作结核分枝杆菌感染的流行病学调查；

④可借用其测定肿瘤病人的细胞免疫功能。

• 第五章 真菌及真菌毒素的检验

第一节 检验技术基础

一、真菌的生物学特征

真菌的基本特性

真菌(fungus)是一类细胞结构完整，具有细胞壁，具有典型的细胞核和完整细胞器，不含叶绿素，无根、茎、叶分化的真核细胞型微生物；大多数为多细胞，由丝状体和孢子组成，少数为单细胞。

组成：

完整的细胞核(核膜和核仁)

完整的细胞器(胞浆)：

多细胞（多数） or单细胞（少数）

生存方式：腐生 or 寄生 繁殖方式：有性 or 无性 生长速度：缓慢

种类繁多、数量大、分布广泛 多数有益：如酿酒、发酵、生产抗生素等

少数有害：人类及动、植物疾病。医学（病原）真菌300多种常见的有50-100种。 真菌症明显上升趋势：

1. 滥用抗生素引起菌群失调 2.用激素、免疫抑制剂、抗癌药物

和HIV感染引起的免疫功能下降 等原因

对人类致病的真菌分为：

w 浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，对治疗有顽固性，但影响身体较小；

w 深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。

w 此外有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起中毒性真菌病。

1、 单细胞真菌：又称酵母菌（yeast），圆形或卵圆形,外

形与细菌相似但较大，出芽方式繁殖。

2、多细胞真菌：又称丝状菌（filamentous fungus）、霉菌（mold），该菌能长出菌丝，菌丝延长分支，有的菌丝上长出孢子，孢子再出芽形成菌丝…。

部分真菌在不同的环境条件下（营养、温度等）可发生单细胞真菌与多细胞真菌两种形态的可逆转换，称为真菌的双相性或二相性(dimorphic)。与某些真菌的感染性与致病性有关

环境条件（营养、温度等）普通培养基， 25℃ 营养丰富的培养基， 37℃

w 组织胞浆菌和球孢子菌

真核细胞的基本结构：细胞膜　　细胞质　　细胞核

w 特殊结构：由特殊成分和结构组成的细胞壁 特殊的隔膜

细胞壁外的成分：荚膜

w 部分酵母菌细胞壁外的一层低密度粘液，如新生隐球菌

w 化学组成：甘露糖、木糖及尿苷酸 与真菌的毒力和致病性密切相关

真菌培养

最常用的培养基：沙保培养基（Sabouraud’s glucose agar）

– 4% malt extract agar

w 温度：多数都在22 ~ 28oC，但深部感染真菌最适温度为37oC，pH4.0 ~ 6.0

w 病原真菌通常生长缓慢，1~4周

培养：沙保培养基

w 沙保培养基（Sabouraud medium）

– 营养不高（主要含葡萄糖、蛋白胨和琼脂）

– 鉴定真菌以沙保培养基形成的菌落形态为准

最适酸碱度为 pH 4～6 最适的温度为 22℃～28℃ 但深部感染真菌在37℃下生长良好 需较高的湿度和氧气

大多数致病性真菌在沙保培养基上生长较慢，需1～4周，但腐生性真菌生长快。 为防止污染，需加入放线菌酮抑制污染真菌的生长及加入氯霉素抑制细菌的生长。

w 沙保培养基成分：

葡萄糖 20g 蛋白胨 5g

琼脂 10g 蒸馏水 500ml

灭菌前沙保培养基的pH要调到5.6，从而抑制细菌的生长。

真菌菌落：

酵母型菌落（yeast colony）为单细胞真菌的菌落，形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖，如新型隐球菌。

类酵母型菌落（yeast-like colony）外观似酵母菌落，但可见伸入培养基中的假菌丝，它是由伸长的芽生孢子形成，如白色念珠菌。

丝状型菌落（filamentous colony）为多细胞真菌的菌落，由许多菌丝体组成。丝状菌落呈棉絮状、绒球状、粉末状或石膏粉样，在下面和背面可显示不同颜色，这些以及菌丝、孢子的形状都是真菌的鉴别依据。

真菌菌落类型

类型

定义

特征

颜色

举例

酵母型菌落

为单细胞真菌的菌落，形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖

光滑、湿润

一般为乳白色

新型隐珠菌

类酵母型菌落

外观似酵母菌落，但可见伸入培养基中的假菌丝，由伸长的芽生孢子形成

光滑、湿润

一般为乳白色

白色念珠菌

丝状菌落

为多细胞真菌的菌落，由许多管状、分枝菌丝体组成

绒毛状、絮状、粉末状、颗粒状、石膏状

可产生各种色素。

毛癣菌

变异性

易变异：经多次传代或培养时间过久，其形态、菌落性状、色素及毒力等都可以发生改变。用不同的培养基和不同温度培养，其性状也可不同。

抵抗力

w 对干燥、阳光、紫外线及常用消毒剂有强抵抗力。

w 不耐热，菌丝与孢子60℃ 1小时均可杀死。

w 2﹪石炭酸、10%甲醛、0.1%升汞、2.5%碘酊敏感。

w 抗真菌药物 ：灰黄霉素、制霉菌素B、二性霉素B、氟康唑和酮康唑

– 对抗生素不敏感

二、霉菌的分离与鉴定方法

w 霉菌的分离在于选用合适的培养基,筛选出纯菌种,并培养成熟。

w 霉菌的鉴定在于确定一种菌的分类地位和种属名称,鉴定是通过霉菌的形态观察和生理实验实现的。霉菌通常以形态鉴定为主。

（一）霉菌形态特征的鉴定

1、培养特征

w 在固体培养基上的培养特征包括菌落生长速度、大小、形态构造、颜色、质地、表面特征、背面特征、边缘特征以及培养基的颜色变化等。

固体培养基

w 在做霉菌培养特性鉴定时,常选用固定培养基进行培养观察。

w 如：曲霉、青霉等选用察氏培养基;

w 根霉、毛霉和半知菌类可采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

w 有些霉菌要求特殊培养时,也可采用特殊的选择性培养基。

2、显微特征

显微观察个体形态特征：霉菌显微特征因种类不同而各异。

w 霉菌的形体较大,营养体和繁殖体的特征比较明显,常可作为霉菌鉴定的主要依据。

(1) 营养体

w ①类型：菌丝体有、无横隔的菌丝组织构成等。

w ②颜色：呈现何种颜色(有黄色、黄褐色、绿色、蓝绿色、白色等)。

w ③分化：有无菌丝分化成的假根或足细胞等。

(2)无性或有性繁殖体

w ①子实体类型：形状、大小、构造(如分枝、囊轴、顶囊等),表面特征(如光滑、粗糙)、颜色、着生状态(单生、集生、囊生、丛生)。

w ②孢子类型：形态、大小、构造(单细胞、多细胞)、表面特征、颜色、着生状态(单生、链生、簇生等)。

（二）霉菌的鉴定步骤

1、分离、纯化菌种： 应用分离培养基和纯种移植法,在相应的培养基上培养出单纯菌株。

2、培养特性的观察：按照培养时间、生长速度、菌落质地、颜色、形态、气味、培养基表面变化、孢子及菌丝的颜色、结构、大小进行观察并记录。

3、显微特征的观察

w (1)制片镜检:

w 在洁净的载玻片上加一滴乳酸-苯酚液,用经过火焰灭菌的接种钩从菌落的边缘挑取少许幼嫩的菌体,置于乳酸-苯酚溶液中,然后加盖玻片,注意不要产生气泡,此为临时性的载片标本;若需保存较长时间,可在盖玻片周围用加拿大树胶封牢,贴上标签,做成半永久性标本。

(2)活体观察

w 活体观察有小培养、大培养和霉变粮粒的显微观察3种方法。

w ①小培养(载玻片培养)：在无菌条件下,滴一滴无菌的培养基于干净的载玻片上,接种后盖上盖玻片,放人已灭菌的培养皿中,用灭菌的湿棉球或纱布保持湿度,盖好皿盖置培养箱中进行培养,可以随时用显微镜观察其生长和发育情况。

w ②大培养(培养皿培养)：即将培养有霉菌菌落的培养皿除去皿盖置于显微镜的载物台上,用低倍镜观察霉菌的生长情况,可以看到其营养菌丝、子实体及孢子等。

w 观察时必须注意:勿让镜头接触霉菌而污染;观察人员不能面对标本,防止孢子飞散吸人体内,影响健康;观察完毕立即加盖,防止污染标本。

w ③霉变粮粒观察：取发霉的粮食颗粒,放在载玻片上,然后用低倍镜观察发霉粮粒上的霉菌生长状态和个体形态。

w ④进行活体观察时,如果倒置显微镜就更方便、更便于观察;如果遇到比较好的菌种标准或视野,也可以用照相机拍下来,苡便长期保存。

4、查对资料、鉴定菌种：根据培养特征、显微特征观察和记录的结果,查对菌属检索表和有关的技术资料,依据菌种的培养性状和个体形态,即可鉴定出霉菌的属、群、系或种。

三、毒素及其测定方法

毒素的检验方法

(一) 化学检验法

w 主要检验黄曲霉毒素

w 6大检验步骤：采样和样品制备→提取→脱脂和净化→分离→鉴定→定量

1. 采样和样品制备

w ①应选霉变部分。

w ②如无可见霉变,样品少时,可混合采样;样品多时、多点采样后混合。

w 采样量一般为20~100g,以50g为宜。样品采回后应尽量磨细,以利提取。

2. 提取

w 根据水溶剂能渗透到亲水性植物组织的原理,提取黄曲霉毒素,可用甲醇-水、丙酮-水或氯仿-水。

w 氯仿-水、二氯甲烷-水等可用于其他真菌毒素的提取。

3. 脱脂和净化

除去脂类的方法取决于提取溶剂的亲脂性。最常用的一种方法是采用两相系统。

例如,为除去提取黄曲霉毒素时氯仿所溶解的脂类,可用甲醇-水/己烷两相系统。

一种常用的方法是采用硅胶柱选择性洗涤法,用石油醚或己烷可除掉氯仿所溶解的脂类。

酸性氧化铝具有高度的净化作用,目前使用者较多。

4. 分离技术

w 根据毒素的溶解力、不同相间的分配力、吸附性能、解离性、分子大小、蒸汽压等加以考虑。

w 目前最常用的分离真菌毒素的技术有薄层层析(TLC)、柱层层析、离心薄层和制备型液相色谱等。

5. 鉴定和定量

(二) 免疫学检验法

1. 放射免疫分析法

w RIA，简称放免法：此法可直接测定牛奶中5~50ng水平的黄曲霉毒素M1,若提取后,其敏感度可达0.5ng/mL。此法也可用于样品中玉米赤霉烯酮、T-2毒素的测定。由于此法需要放射性同位素,一般地区不易推广。

2. 酶联免疫吸附试验

w ELISA，简称酶标法：是应用酶标记的抗体(或抗原)在固相支持物表面检测未知抗原(或抗体)的方法。

w ELISA方法的基本原理：

w 是酶分子与抗体或抗原共价结合,此种结合不会改变抗体的免疫学特性以及酶的生物学活性,酶与抗体(或抗原)交联后,形成酶标记抗体-抗原复合物,加入酶底物和显色剂,在酶催化底物液体后呈现显色反应,液体显色的强弱和酶标记抗体-抗原复合物的量成正比,进而得知待检测的抗原或抗体量。

(三) 生物学检验法

主要是利用各种生物来测定毒素的毒性和 “三致” (致癌、致畸、致突变)性。

1. 动物毒性试验

w 动物毒性试验包括急性毒性试验、亚急性毒佳试验、慢性毒性试验以及致癌、致畸、致突变试验等。

w 由于动物对霉菌毒素的反应存在较大的种间差异,所以,进行动物试验时,最好选用多种动物,以便发现最敏感的测毒动物,全面的评价该毒素的毒性。

攻毒的途径主要是消化道。可采用自由摄食,比如把被检物拌于饲料之中饲喂。也可采用人工灌胃的方法

2. 鸡胚试验

w 黄曲霉毒素的生物鉴定方法常用鸡胚进行试验。

w 优点：敏感性高,操作简便,不需要特殊仪器,而且重复性强。

w 缺点：特异性较差,鸡胚没有特异性病变。

w 操作步骤:

w 受精卵于孵化前在气室位置上将蛋壳小心开孔,从该孔处注入一定剂量的试验样品,使其附着于卵膜上,用玻璃纸贴于洞口封固,并保持气室向上的直立位置约1h,使样品渗入。

w 从孵育的第四天开始,应每日观察胚胎存活情况,一般最早出现死亡的是在第四天以后。

w 试验中应作空白对照及注射用的溶剂(不含AFB1)对照。

3. 植物毒性试验

w 黄曲霉毒素有抑制某些植物种子发芽的作用,而且能使叶片失去叶绿素,变为黄色甚至白色,对幼苗叶片的色素影响更为明显。

w 其他霉菌毒素也具有这些作用,但抑制发芽及引起变色作用的含量比AFB1大。

4. 组织培养法

w 遗传性的影响包括对细胞有丝分裂的抑制、核酸合成的抑制、酶的活性的转换(包括DNA的合成)、变异型的产生(如巨细胞的产生)等。

w 非遗传性的影响主要表现在组织细胞的破坏、细胞数目减少、细胞核的退行性变化等病理改变。

5. 对微生物的抑制试验

w 具体方法：将已知浓度含量的黄曲霉毒素的滤纸片或滤纸条,贴在涂有已知菌的平板上,30℃ 培养18h,观察抑菌圈的大小。

w 试验证明,巨大芽孢杆菌和短芽孢杆菌对黄曲霉素最敏感,产生抑菌作用的最低毒素浓度为5~10ug/mL(粗制黄曲霉毒素)。

第二节 真菌的致病性与免疫性

w 一、致病性

1、致病性真菌感染：外源性真菌感染

w 浅部真菌—真菌的嗜角质性，产生角蛋白酶，水解 角蛋白；皮肤局部繁殖时造成的机械刺激和代谢产物毒性作用，引起局部炎症和病变

w 各种皮肤癣病

w 深部真菌—吞噬细胞内繁殖，慢性肉芽肿或组织溃疡坏死

2、条件致病性真菌感染：内源性真菌感染

w 致病性弱，只有在机体免疫力降低时引起感染

w 内源性真菌感染多见于长期大量使用广谱抗生素、皮质激素、放射治疗或导管介入、手术等过程易于发生肿瘤、白血病、糖尿病、免疫缺陷病

w 如念珠菌、曲霉菌、毛霉菌等

3、真菌变态反应性疾病：

过敏体质者，吸入菌丝或孢子引起 哮喘、变态性皮炎、鼻炎、荨麻疹等。

w 如青霉菌、镰刀菌、曲霉菌、交链孢霉等

4、真菌性中毒症（mycotoxicosis）

粮食或饲料受潮霉变，摄入真菌或其产生的毒素后可引起急、慢性中毒称为真菌中毒症，可引起肝、肾、血液、神经系统损害。

w 如黄曲霉菌、杂色曲霉菌、岛青霉菌等。

5、真菌毒素与肿瘤

黄曲霉毒素是肝癌病因或促发病因的重要因素之一。

肝癌高发区的花生、玉米、粮油作物中，黄曲霉污染最高，黄曲霉毒素含量高；

该毒素毒性很强，有致癌性，其中B1 致癌作用最强；该毒素耐热，粮食被污染后，加热不能祛除。

赭曲霉产生黄褐毒素诱发动物肝肿瘤； 镰刀菌T-2毒素诱发大鼠胃癌、胰腺癌、脑肿瘤； 展青霉素引起局部肉瘤； 曲霉菌诱导曲霉瘤等

二、免疫原性

天然免疫：皮肤粘膜屏障作用（皮脂腺分泌物杀菌）；

正常菌群拮抗作用；

吞噬作用（促癣吞噬肽、转铁蛋白）

获得性免疫：细胞免疫为主；特异性抗体（包括SIgA）阻止真菌转为

菌丝和发生粘附

第三节 真菌的常规检验法

实验室检查：

w 标本采集 分离培养

w 直接镜检 生化反应

w 染色镜检 免疫学试验

一、临床标本的采集

w 1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。

2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。

w 3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。

4．脓汁及渗出物。

二、检验方法

（一）标本直接检查法

w 不染色标本检查

染色标本检查

（二）培养检查

（三）鉴定

①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。

②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）

③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。

④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。

微生物学检查步骤：

取患部标本

（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化

→镜检（观察菌丝和孢子）

直接镜检的意义

①有诊断意义，如浅部真菌病等；

②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等；

③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。

直接镜检的局限性：

①阴性结果不能排除真菌感染；

②有假阳性结果。

因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。

2. 染色标本检查

w （1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。

w （2）乳酸酚棉蓝染色

w （3）糖原染色：

w 又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。

w （4）嗜银染色（GMS）：染成黑色

w （5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。

w （6）荧光染色： 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。

（二）培养检查法

w 本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。

①菌落性质：酵母菌还是霉菌；

②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；

③菌落颜色： 病原性真菌颜色淡， 污染真菌颜色深；

④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉，很少引起开裂。

标本培养观察

标本→ 沙保培养基→ 观察菌落形态、假菌丝

标本→ 玉米粉琼脂培养基→ 观察厚垣孢子

2、培养方法

w 接种工具为接种针、接种钩、接种环、接种铲（刀）

w （1）试管培养：多用于菌种传代接种与保存。

w （2）大培养：用平皿或培养瓶培养。

w （3）小培养 可观察结构特征及发育的全过程。

w 1）玻片小培养法

w 2）郭可大钢圈小培养法：

w 材料：培养基、钢环（用铁环或废电线的铝丝制成）、载玻片、盖玻片、毛细管、石蜡等。

钢圈小培养法

先将无菌钢圈以热石蜡固定在玻片和盖玻片之间，钢环开口处深入底部加入培养基。加够半环即可凝固。用接种针取少量材料，接种在培养基表面。 　　

将接种好的玻片，放在平皿内，并放湿纱布以防干燥。逐日镜检，一般约7ｄ即可长好。根据菌丝和孢子的结构特点进行真菌类别的鉴定。

真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养真菌的温度为28℃，但深部真菌为37℃。菌落形态是鉴别真菌的判断依据。

动物实验

目的是分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药物对真菌的作用等。

如假丝酵母菌接种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀，肾皮质部位有白色脓疡。

（三）真菌的鉴定

1.真菌的生化反应

用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。

1）糖(醇)类发酵试验 37℃，观察糖发酵情况。

2）同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45℃)混合，然后在培养基上分别加糖，置25℃孵育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化则在糖周围有生长圈，否则无生长圈。一般对双糖发酵的真菌能同化或利用糖类或碳源。主要用于酵母菌的鉴定。

3）同化氮源试验 同化碳源试验相同，但 需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。用于观察酵母菌对硝酸钾的利用情况。

4）明胶液化试验：某些真菌可液化明胶。

5）尿素分解试验 石膏样癣菌、新生隐球菌等可分解尿素。

6）测定淀粉样化合物：某些真菌可产生淀粉样化合物，遇碘后变成兰色

7）牛乳分解试验；真菌可使牛乳酸化、凝固、胨化、碱化等

2、芽管试验

取少许待检的白色念珠菌接种于0.5mL人或兔血清中，混匀，直37℃水浴2-3h后，取出一接种环菌液，涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。

3、厚垣孢子形成试验

w 本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉聚山梨酯-80琼脂培养基培养本菌，镜检观察到厚垣孢子及假菌丝。

4、核酸检测

G+C mol％分类鉴定法

常用热变性温度法。

原理是DNA加热变性使碱基氢键被打开，双链螺旋变成单链，导致核苷酸碱基在260nm紫外吸收明显增加，完全变成单链后，紫外吸收增加停止。紫外吸收增加的中点值温度为热变性温度（Tm）。

真菌DNA中 G+C 碱基对含量多，Tm值就高。

可直接反映 G+C 碱基对的绝对含量。

计算公式为：G+C mol％=(Tm-53.9)×2.44

真菌核型的脉冲电泳分析

原理：PFGE有两个方向的电场在设定的脉冲时间里交替变换，使大分

子DNA在移动中不断改变自己的形状及迁移方向，从而绕过细小的凝胶

孔隙而得以分离。较大的DNA分子泳动慢些，较小的快些，有许多因素影

响电泳带型，分离真菌等大分子量的DNA宜用较低电压和较长脉冲时间。

用PFGE分析真菌核型，可直接比较其遗传背景,从电泳核型差异中进行

分类鉴定,又能取得基因结构的基本数据，构建出大尺度物理图谱。

随机扩增多态性DNA(RAPD)分析

RAPD分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物，通过PCR扩增靶细胞

DNA，扩增产物凝胶电泳，分析DNA片段大小和数量的多态性，从而比

较靶基因差异的一种技术。由于病原性真菌基因组庞大，RAPD分析适

用于真菌的鉴定与分类。

5、免疫学试验

用于检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。

w 检测深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、特异的诊断。

v 乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原

v ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原

v 免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原

v 放射免疫法检测组织胞浆菌的循环多糖抗原

6、荧光检查

本法主要用于头癣检查。病发在滤过紫外灯照射下可发出不同色泽的荧光，如黄癣菌病发呈暗绿色荧光，白癣小孢子菌属的病发呈亮绿色荧光等。

微生物检验方法

1．直接镜检：常用墨汁涂片法。

2．分离培养：在沙保培养基上，室温、37℃ 2～3天即可长出典型酵母型菌落。有荚膜者菌落粘稠。

有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色，难以发现，称隐球菌

在沙保氏琼脂及血琼脂培养基上，于25及37℃皆可生长，而非病原性隐球菌在37℃不能繁殖。

3．糖同化及发酵试验：本菌不发酵各种糖类，但能同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、肌醇，不同化乳糖。

4．酚氧化酶试验：在含Ｌ-多巴橘橼酸铁和咖啡酸培养基中，经２～５天培养，新型隐球菌出现棕黑色菌落。

５．尿素酶试验：新型隐球菌产生尿素酶，在尿素培养基（含尿素及酚红指示剂）中分解尿素形成氨和CO2，以致培养基的pH值升高，使酚红由黄变为粉红色为阳性，而白色念珠菌为阴性。

三、 真菌感染的防治原则

1、对于皮肤癣菌的感染，应注意个人卫生并辅以抗真菌药物治疗；（达克宁霜剂、癣药水等）

2、对于深部感染真菌，去除各种诱发因素，应以提高机体免疫力为主并辅以抗真菌药物治疗；

3、治疗 抗真菌药物主要有：两性霉素B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑、灰黄霉素、克霉唑等，但应注意这些药物的毒副作用。

四、真菌毒素的检测

真菌产生有毒的代谢产物，可引起急慢性真菌中毒症，引起消化道中毒症状，而且可进入人体内引起病变，如引起肝脏损伤的黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素；引起肾脏损害的桔青霉素；引起中枢神经系统损害的黄绿青霉素等。

甚至有的毒素具有致癌性，如黄曲霉毒素与肝癌发生有关。

检测真菌毒素有许多方法，如检测黄曲霉毒素有生物学方法和ELISA法等。

w 生物学方法主要用于检测真菌毒素的毒性，如用鸡胚、小白鼠作毒性试验，观察动物中毒死亡或出现肿瘤。

w ELISA法操作简便，并具有安全快速高效、费用低，适用于大批量标本的筛选。

第四节 病原真菌及检验技术

一、感染性病原真菌

1、组织胞浆菌属

w 本属为典型的双相型真菌，37℃呈酵母样细胞，25℃培养形成菌丝体。

w 重要的致病菌有荚膜组织胞浆菌及假皮疽组织胞浆菌，分别致犬、猫肉芽肿及马的淋巴管炎。

①荚膜组织胞浆菌

引起人兽共患病是致犬、猫和人常发的高度接触性传染性组织胞浆菌病。严重者，可损伤全身器官。

淋巴瘤、白血病、霍奇金病、AIDS或用肾上腺皮质激素治疗者常可感染本菌。

主要侵犯网状内皮系统，寄生在网状内皮细胞的胞浆内，使感染组织形成肉芽肿。奶牛、马、羊、猪及啮齿类动物也可自然感染，小鼠易感染。

微生物特性

w 在巨噬细胞和网状细胞内寄生时呈细小的、包有荚膜的圆球样细胞，直径l~3μm。在陈旧的病灶内，菌体较大，胞浆浓缩于菌体中央，与细胞壁之间出现一条空白带。

w 22~25℃培养时，在培养基上缓慢形成丝状菌落，开始为白色，逐渐变为棕黄色。菌丝分支分隔，宽2.5μm。产生椭圆形光滑或多刺小分生孢子，直径2.5~3μm，随后可产生圆形或椭圆形大分生孢子，称棘状厚壁大孢子，直径8~15μm，表面光滑、均匀间隔的，像手指一样凸起，是本菌的特征性形态.

w 在高湿、高浓度的二氧化碳中37℃培养时，在营养丰富的血培养基上，可形成湿润、有光泽、表面有皱褶的细小酵母样菌落；在肉汤中呈絮团状生长，镜检可见分支分隔的菌丝和少量孢子。

w 镜检如发现特征性的棘厚壁大孢子，可做出诊断。

w 活体病变组织末梢血及骨髓触片或涂片瑞氏染色，在单核细胞或多形核细胞中如有小的、呈洋葱切面样卵圆形孢子，亦可做出诊断。

w 病料接种小鼠可引起发病死亡，并可检出本菌。

w 补体结合反应一般在发病后2~3周呈阳性反应。

w 皮内变态反应试验可用于犬感染的流行病学调查。

w 亦可采用PCR和核酸探针技术鉴定,

微生物检验

(1)标本直接显微镜检查

w 　痰液标本涂片后先用甲醇固定10 min，再用姬姆萨染色镜检，如巨噬细胞发现卵圆形孢子，直径2～4μm的较小，一端有出芽，可疑为荚膜组织胞浆菌。

(2)抗原检测

w 　取患者痰液作免疫荧光法染色后镜检，可快速检测其抗原，但特异性差，仅作组织胞浆菌初筛试验。

(3)分离培养——两相型

w 　将临床标本接种于含抗生素的沙氏培养基上，25℃培养，生长缓慢，4～6周才开始生长，逐渐形成白色至棕色绒毛状菌落。当转种于血琼脂培养基上，37 ℃很快形成酵母型菌落。

(4)鉴定——生化反应

w 　取可疑菌落涂片染色镜检，并作脲酶试验和明胶液化试验。荚膜组织胞浆菌分解尿素；不能液化明胶。

(5)药物敏感试验

w 组织胞浆菌对两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑敏感。

(6)抗体检测

w 检测血清中组织胞浆菌抗体，以补体结合试验的敏感性和特异性最高，发病2-3周阳性率可达90％，有判定价值。

w 补体结合试验的抗体效价在１：32以上为阳性，抗体效价4倍增长，可有助于确诊。

w 乳胶凝集试验时，抗体效价为1：32时可确诊。

②假皮疽组织胞浆菌

w 马属动物流行性淋巴管炎的病原，特征为皮下淋巴管和淋巴结发炎、肿胀和皮肤溃疡。在自然情况下，马、骡最易感，驴次之；人、犬、骆驼、牛、猪很少感染；家兔、豚鼠人工感染可引起局部脓肿。

微生物特性

w 在脓汁中该菌呈卵圆形或瓜子形，是具有双层膜的酵母样细胞。大小为2~3μm×3~5μm，一端或两端较尖，多单在或2~3个排列，菌体胞浆均匀，可见2~4个圆形、呈回旋运动的小颗粒。在培养物中呈菌丝状，分支分隔、粗细不匀，菌丝末端形成瓶状假分生孢子。

w 本菌为需氧菌，最适生长温度25~30℃，最适生长pH5~9，常用培养基有1%葡萄糖甘露醇甘油琼脂、2%葡萄糖甘油琼脂等。

w 不发酵多种糖类，不产生靛基质和H2S，VP试验阴性，能凝固石蕊牛乳，液化明胶。

w 取脓汁或分泌物，适当稀释、镜检，或取痂皮，加10%KOH处理透明后，制片镜检。

w 必要时可进行分离培养，病料应先用青、链霉素处理12h后再接种。长出典型菌落时，用生理盐水制成悬液，接种家兔或豚鼠，观察有否脓肿，作为诊断参考。

w 可根据是否产生变态反应做出诊断。方法是用该菌的培养物颈部皮内注射，48~72h后测定皮肤增厚及肿胀性质，如注射局部发生硬固的热痛肿胀，皮肤增厚超过5mm即为阳性。此法特异性强，检出率高达80%以上。

w 应用经高压后酒精或乙醚提取的抗原进行沉淀反应、补体结合反应检查马血清中的抗体，也是有效的诊断方法。

2、念珠菌属

w 该菌属半知菌纲的酵母菌

w 念珠菌属有150多个种，仅白色念珠菌是常见的病原，致人和动物的念珠菌病。

w 白色念珠菌存在于人和动物消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜，是机会致病菌，

w 患念珠菌病的动物多在消化道黏膜形成乳白色伪膜斑坏死物，主要侵害家禽，特别是雏鸡。牛、猪、犬和啮齿动物也可能感染。

白色念珠菌致病性

条件致病

皮肤粘膜感染 鹅口疮，阴道炎

内脏感染：肺炎、关节炎、膀胱炎，肾盂肾炎

中枢神经感染：脑膜（脑）炎、脑脓肿

过敏

微生物特性

w 假丝酵母菌

w 呈圆形或卵圆形，直径3-6μm。革兰阳性，着色不均匀。出芽方式繁殖。

w 在组织内可见芽生孢子、假菌丝；

w 在玉米粉培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。

微生物检验

(1)直接显微镜检查：取脓汁、痰和局部炎症性分泌物直接涂片，革兰染色后镜检，显微镜见到革兰阳性(着色不均匀)、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝，可确认为假丝酵母菌感染。

(2)抗原检测：取病人血清作ELISA、免疫印迹法等检测白色念珠菌抗原。

(3)核酸检测：用PCR法将白色念珠菌DNA分子扩增后以分子探针检测，具有较好的敏感性和特异性。

(4)分离培养

将标本接种在沙氏培养基上，25℃或37℃培养1～４d后，可出现奶油色类酵母型菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。

(5)鉴定:

1)芽管形成试验：将假丝酵母菌接种于0.2～0.5m|血清中，37℃孵育1.5～４h观察有无芽管形成。白色念珠菌可形成芽管，其他假丝酵母菌不形成芽管。

2)厚膜孢子形成试验：将假丝酵母菌接种于玉米粉培养基25℃孵育1-2d后，白色念珠菌在菌丝顶端、侧缘或中间形成厚膜孢子。

3)糖同化或发酵试验

w 凡发酵某种糖一定能同化该糖，故只需做那些不发酵糖的同化试验。

w 将假丝酵母菌接种糖发酵管，25℃孵育，一般观察2～3d，对不发酵或弱发酵管可延长至10d或2-4周。观察有无酵母生长或液体培养基是否变混浊。

w 现在商品化的产色培养基可快速鉴定白色念珠菌和其他假丝酵母菌。

(6)药物敏感试验：对二性霉素B、5-FC等药物敏感，但对5-FC极易产生耐药性。

(7)抗体检测：早期诊断可用ELlSA夹心法、免疫酶斑点试验，方法简便。也可用乳胶凝集试验和对流免疫电泳试验等检测血清中抗白色念珠菌抗体。

(8)动物试验：将假丝酵母菌悬液注射1ml于家兔耳静脉或注射0.2ml于小白鼠尾静脉，假丝酵母菌对动物无致病性。

3、隐球菌属

w 包括17个种和7个变种，广泛分布于自然界，人体体表、口腔和肠道中。

w 外源性感染, 经呼吸道侵入，由肺经血行播散,可侵犯肺、脑及脑膜、皮肤、骨和关节。

w 好发于细胞免疫功能低下者，如AIDS、恶性肿瘤、糖尿病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者。

w 现已发现新生隐球菌、浅白隐球菌和罗伦隐球菌有致病性。

新型隐球菌

w 引起的人兽共患病

w 新型隐球菌在自然界广泛存在，可从土壤、空气、水果、牛乳，以及人的皮肤、肠道中分离到。

w 易感新型隐球酵母病的动物有犬、猫，猪、马、牛和禽类，特别是鸽子，可作为其自然寄主和主要传染体。

w 其主要传染途径是：孢子随尘埃被人吸入后停留于肺部，继而血行播散；通过体表外伤侵入人体；食用被污染，特别是被鸽粪污染的食品，发生肠道感染，继而血行播散。进入人体的病菌可到达很多部位并发病，其中以中枢神经系统症状为最常见，如脑膜炎，其次有肺炎、肾炎、败血症以及皮肤、骨骼等症状。

微生物特性

w 在组织中呈圆形或卵圆形，直径一般在4～6μm，外周有宽厚荚膜，荚膜较菌大1～3倍，折光性强，一般染色法不易着色而难以发现而得名。常采用墨汁负染色法，在黑色景下可镜检到透亮菌体和宽厚荚膜。

w 非致病性隐球菌无荚膜。

微生物检验

(1) 标本直接镜检：

w 用病人脑脊液作墨汁负染色检查是诊断隐球菌脑膜炎最简便、快速方法。

w 常规细胞染色可发现隐球菌，但易误诊和漏诊。如用PAS染色后新生隐球菌呈红色。

(2) 抗原检测

w 用乳胶凝集试验、ELISA、和单克隆抗体法等免疫学方法检测隐球菌荚膜多糖特异性抗原，已成为临床上的常规诊断方法。

w 其中以乳胶凝集试验最为常用，此法简便、快速。特别对直接镜检和分离鉴定阴性者更有诊断价值。

w ELISA敏感性和特异性都较高。

w 单克隆抗体法除有较高敏感性和特异性外，标本无须稀释和预先处理的优点。

(3) 核酸检测

w 可用痰液、支气管吸出物等标本核酸检测方法有DNA探针法、PCR探针法等，用于检测的探针、引物主要选自保守区的重复序列。

w 可检出新生隐球菌，并可区别类型，是新生变种还是格特变种。非致病性隐球菌不被检出。

w 此方法不受药物治疗的影响，还能正确评价临床疗效和愈后等。

(4) 分离培养

w 将标本接种在沙氏培养基上，病原性隐球菌在25℃和37℃生长，而非病原性隐球菌在37℃时不生长。

w 培养2—5d后观察菌落形态特点，并取菌落作印度墨汁负染色镜检。

(５) 鉴定

1）酚氧化酶试验：接种L-多巴枸橼酸铁和咖啡酸培养基中，经2～5d培养，呈棕黑色菌落。

2）脲酶试验：能产生脲酶分解尿素琼脂培养 基中的尿素形成NH4+和CO2，使pH升高，培养基可由黄色变粉红色，而白假丝酵 母菌为阴性。

3）糖同化及发酵试验：能同化葡萄糖、 半乳糖、蔗糖和肌醇，但不能发酵多糖 类，不能同化硝酸盐。非致病性隐球菌不能同化肌醇。

丝囊霉菌

微生物特性

w 外形与真正的真菌相似，由纤细的分支的丝状菌丝组成。但细胞壁由纤维素构成，而大多数真菌的细胞壁成分是几丁质。

w 丝囊霉菌还有管状的线粒体嵴，也有别于真正的真菌。菌丝的一系列片段均可发育成孢子囊。孢子囊的形成和发射孢子的适宜温度为16~24℃，但完成从初级孢子到次级游走孢子形成过程的适宜温度是24℃。次级游走孢子运动缀慢而不协调。

w 不同基因型的螯虾丝囊霉菌在生活过程中均会产生高水平的几丁酶，有一定鉴别意义。

微生物检验

w 通过病原分离和形态学鉴别迸行诊断。无菌切取感染组织1~2mm2的小片置分离培养基表面，室温下培养，将出现的菌丝转移到新鲜的琼脂平板上，直到平板无其他污染菌为止。

w 鉴定丝囊霉菌属必需诱导并观察孢子形成。取带有生长活力菌丝的一小块琼脂（直径3~4cm），置于GPY肉汤中20℃孵育4d，用灭菌的池塘水洗5次，然后于其中20℃过夜。大约12h后形成原代孢囊群落，在显微镜下可见出现能游动的次级游走孢子。再结合典型的丝囊霉菌无性繁殖特征可鉴定到种。

w 近年来发展的PCR、原位杂交等技术可检测种特异性rRNA基因，简便快捷，适用于大规模样品的检测。

5、肺孢菌属

w 肺孢菌是一种机会病原微生物，可感染马、牛、羊、猪、犬、猫、鼠等多种动物，有宿主特异性。

w 在正常健康的宿主体内通常不表现明显的临床症状，而在免疫功能低下的动物体内可引起严重的肺炎。特征为明显的呼吸道症状，普遍性或局灶性肺炎，肺泡内充满孢子。

卡氏肺孢菌

w 为感染动物的肺孢菌

w 曾称为卡氏肺孢子虫。分类还存在一些争议。已往大多数学者依据抗原虫药有效和具有孢囊、滋养体两种形态，认为应属于原虫。

w 近来分子生物学研究发现，卡氏肺孢子虫线粒体的16s和5s核糖体RNA的核苷酸序列与真菌有更多的同源性，染色特性也类似真菌，应归属于真菌。

w 卡氏肺孢菌广泛分布于自然界，主要是空气传播，在健康人体内，多为无症状的隐性感染。

w 当宿主免疫力下降，潜伏的卡氏肺孢菌在病人肺内大量繁殖扩散，使肺泡上皮细胞受损，导致间质性浆细胞肺炎，又称卡氏肺孢菌性肺炎, 是AIDS最常见、最严重的机会感染性疾病，病死率高达70％—100％。

微生物特性

w 生活史有包囊和滋养体两种形态。

w 滋养体壁较薄，单个核，形态不规则，直径2～5μm，姬氏染色后胞质呈蓝色，核呈紫红色。

w 包囊为感染型，滋养体为繁殖型，呈二分裂法繁殖。

w 包囊分为成熟包囊和未成熟包囊，前者壁较厚，直径6～8μm，呈球形，内含8个囊内小体，大小1～1.5μm，呈球形排列规则或不规则单个核；后者一般呈椭圆形，3～5μm，囊内核 1～8个。

微生物检验

(1) 标本直接显微镜检查

w 收集病人痰液和纤维支气管镜取材，涂片姬氏染色后镜检，可见包囊内的8个囊内小体，胞质呈浅蓝色，核1个呈紫红色。

(2)抗原检测：用单克隆抗体来检测病人血清中卡氏肺孢菌抗原，有较好的敏感性和特异性。

(3)核酸检测：现已将卡氏肺孢菌线粒体中的5s rDNA和16s rDNA扩增成功。基因探针可用于标本检测，其敏感性和特异性都可以，但技术难度高。

(4)抗体检测 用IFA、ELISA、CFT检测人群血清中卡氏肺孢菌抗体，可用于流行病学调查，临床诊断价值不大。

二、中毒性病原真菌

w 凡能产生毒素、导致人和动物发生急性或慢性中毒症的真菌，称为中毒性病原真菌。

w 即使是同一种真菌，例如串珠镰刀菌，也不是所有菌株均能产生毒素，只有产毒素的菌株才有病原性。

真菌毒素的种类

肝脏毒:主要致肝细胞变性、坏死，或引起肝硬化、肝癌，如黄曲霉毒素等。

肾脏毒:主要引致急性或慢性肾脏病变，可使肾功能完全丧失，如橘青霉素等。

神经毒 : 主要造成大脑和中枢神经系统的损害，引起严重的出血和神经组织变性，如黄绿霉素。

造血组织毒 :主要损害造血系统，发生造血组织坏死或造血机能障碍、白血球减少症等，如某些镰刀菌毒素。

毒素的产生

w 首先取决于菌株，其次依赖于外界环境，如基质、温度和湿度。

w 基质对霉菌的生长和产毒有一定的影响。一般而言，真菌产毒菌株主要在食物、粮食、饲草等植物上生长产毒，在乳、蛋等动物源基质上产毒能力较低。

w 霉菌的生长繁殖与温度有密切关系，大多数最适温度为25~30℃，低于l0℃或高于40℃生长减弱，产毒素能力也会受到影响。

w 基质的水分、空气的湿度与真菌的生长繁殖和产毒素能力密切相关，基质含水量在17%~18%时为真菌产毒素的最适条件。

毒素的检验

检测真菌毒素有许多方法，如检测黄曲霉毒素有生物学方法和ELISA法等。

生物学方法主要用于检测真菌毒素的毒性，如用鸡胚、小白鼠作毒性试验，观察动物中毒死亡或出现肿瘤。

ELISA法操作简便，并具有安全快速高效、费用低，适用于大批量标本的筛选。

中毒性

1青霉菌属:本属的基本形态：营养菌丝从无色到有鲜明颜色，菌丝有隔，分生孢子梗有隔，光滑或粗糙，顶端有呈扫帚状的轮生分支，称帚状支；分生孢子星球形、椭圆形或圆柱形，光滑或粗糙大，部分呈黄绿、绿或灰绿色。

①黄绿青霉

w 又称毒青霉。分布广泛，可从霉变米或土壤中分离。本菌分生孢子梗从贴于基质表面的菌丝中生出，壁光滑。帚状支多为单轮，分支较少，小梗密集。分生孢子呈球形或近似球形，直径2.2~2.8um，壁薄而光滑，呈串状，可达50um以上。

w 在琼脂培养基上室温培养12~14d，菌落直径为2~3cm，其表面有皱褶呈纽扣状，中心隆起或凹陷，厚度为100~200um。大部分菌落呈明显的柠檬色及黄绿色，经14d后变成浊灰色，表面呈绒状或絮状，略带霉味。

w 黄绿青霉的代谢产物，是很强的神经毒素，为橙黄色柱状结晶，紫外线照射2h毒素被破坏。耐热，270℃才能失去毒性。

w 在霉变米中提取的黄绿青霉素可使动物发生急性中毒,特征为中枢神经麻痹，24h内即可致死。

w 该毒素可使猫、犬、猴、兔、大鼠发生中毒。

w 猫引起呕吐、痉挛、上行性脊髓麻痹，伴有血压下降和心力及呼吸衰竭，还能引起肝肿瘤和贫血症。

w 毒素主要分布在脑、肝、肾、脾脏中。

②橘青霉

w 是粮食常见的霉菌之一，侵害大米后，形成有毒的黄变米。

w 本菌分生孢子梗大部分从基质上产生，也有从菌落中央的气生菌丝上生出的，壁光滑、不分支，帚状支由3~4个轮生而略散开的梗基构成，每个梗基上生出6~10个密集而平行的小梗。分生孢子呈圆形或椭圆形，壁光滑，直径为2.2~3.2um，形成串状孢子链。

w 在琼脂培养基上生长局限，24~26℃培养10~14d，菌落直径为2.0~2.5cm，有典型的放射状皱纹，呈绒状或絮状，正面绿色，反面黄色至橙黄色，有明显的蘑菇气味。

w 是粮食常见的霉菌之一，侵害大米后，形成有毒的黄变米。

w 本菌分生孢子梗大部分从基质上产生，也有从菌落中央的气生菌丝上生出的，壁光滑、不分支，帚状支由3~4个轮生而略散开的梗基构成，每个梗基上生出6~10个密集而平行的小梗。分生孢子呈圆形或椭圆形，壁光滑，直径为2.2~3.2um，形成串状孢子链。

w 在琼脂培养基上生长局限，24~26℃培养10~14d，菌落直径为2.0~2.5cm，有典型的放射状皱纹，呈绒状或絮状，正面绿色，反面黄色至橙黄色，有明显的蘑菇气味。

③岛青霉

w 亦称冰岛青霉，分布广泛，主要在大米、玉米、大麦中生长，产生岛青霉毒素。

w 分生孢子梗短，一般为50~75um，呈分支状，从气生菌丝上产生，帚状支为双轮对称，小梗平行密集，每簇5~8个，较短，顶端聚尖，大小为7~9um×1.8~7.2um。分生子为椭圆形，2.2~3.0um×3.0~3.5um，壁厚光滑，产生短的结节状分生孢子链。

w 在琼脂培养基上生长缓慢，窒温下培养14d菌落直径达2.5~3cm，具有显著的环带及轻微的放射状皱纹，菌落呈黄橙色、橘红色、褐色及暗绿色等多种颜色。

w 按结构可分为黄天精及环氯素两种，均为肝脏毒.

w 黄天精，呈黄色六面体针状结晶，脂溶性。急性中毒引起动物肝萎缩，慢性中毒引起肝纤维化、肝硬化或肝肿瘤。用人工污染岛青霉的大米感染小鼠，喂100%霉大米组3~8d，大部分死于急性肝萎缩，30%和10%霉大米组，在300d后出现肝硬化和弥漫性肝萎缩。

w 环氯素，又称含氯肽，白色针状结晶，水溶性。毒性作用与黄天精相似，但急骤，急性中毒时体温降低、竖毛、昏睡而死；肝充血、肥大，有时小肠出血。

2、镰刀菌属(又名镰孢属)

镰刀菌的毒素

w 产生的毒素十分复杂，大致可分为3大类:

w 一类是玉米赤霉烯酮；

w 另一类为单端孢霉烯族化合物毒素，包括T2毒素、DON、DAS、伏马毒素等; 第三类为丁烯酸内酯。

玉米赤霉烯酮毒素

单端孢霉烯族化合物毒素

w T2毒素和DAS毒素是上皮坏死因子，致皮肤口腔及上消化道上皮坏死及溃疡。

w T2毒素对生长猪有免疫抑制作用，B淋巴细胞减少，血清总蛋白水平降低，消化道出血、肝、肾退行性变化。

w 此外，T2毒素还有致突变及致畸作用。

w 20世纪30、40年代发生于前苏联的高死亡率的“食物中毒性白细胞减少症”与T2毒素密切相关。

伏马毒素 有4种：A1、A2、B1和B2，主要是由串珠镰刀菌等产生

丁烯酸内酯毒素

③丁烯酸内酯为棒状结晶产生菌：三线镰刀菌、雪腐镰刀菌、木贼镰刀菌、拟枝孢镰刀菌和梨孢镰刀菌毒性：主要引起水牛的“蹄腿腐烂病”，喂饲带此毒素的霉败稻草后，蹄和皮肤处破裂，有时蹄匣脱落或尾尖、耳尖干性坏死. 毒素检测： 腹腔接种小鼠，引致精神委顿、腹泻、胃肠出血，口部有坏死灶，最终死亡。

感染性、中毒性

三、曲霉菌属

w 曲霉菌是丝孢目丛梗孢科的真菌。

w 广泛分布于自然界，达900余种，分为18个群，对工业和医药的用途很大。酿酒造酱，生产有机酸及酶制剂，抗生素等。

w 曲霉菌是实验室经常污染的真菌之一。可感染动物，也可在寄生的饲料、粮食中产生毒素，动物食后引致中毒。

w 人体对曲霉有极强免疫力，只有在免疫功能降低时才能致病，如使用免疫抑制剂、肾上腺皮质激素，放疗化疗，各种恶性肿瘤、糖尿病、AIDS等可诱发曲霉病。

w 曲霉可侵犯许多部位，呼吸系统曲霉病主要有三种：过敏型、曲霉球和肺炎。全身性曲霉病多发生败血症，危及生命。

w 曲霉产生黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素与原发性肝癌有关。

w 黄曲霉、寄生曲霉、棕曲霉、杂色曲霉等主要以所产毒素而致病。

微生物特性

菌丝：有隔，多细胞性，有分枝足细胞（接触培养基的部分，厚壁而膨大）

分生孢子梗：从足细胞直立

顶囊：孢子梗顶端膨大，半球形或椭圆形

小梗：顶囊上，辐射状，一层或二层杆状

分生孢子：小梗顶端，成串，球形或柱状， 黄、蓝、棕黑

分生孢子头：菊花样的头状结构（顶囊，小梗，分生孢子）

菌落：绒毛状或絮状开始为白色，后菌种不同颜色不同

繁殖：多数：无性 少数：有性

1、烟曲霉（A. fumigatus）

烟曲霉广泛分布于自然界，在禽舍的地面、垫草、用具及空气中经常可分离出其孢子。

孢子对外界理化因素的作用有较强的抵抗力，煮沸5min，可被杀死；

一般消毒液要经1~3h才能杀死孢子。对一般的抗生素均不敏感，

制霉菌素、两性霉素B、灰黄霉素及碘化钾对本菌有抑制作用。

w 烟曲霉菌是曲霉菌属致病性最强的霉菌。

主要引起家禽的曲霉性肺炎及呼吸器官组织炎症，并形成肉芽肿结节。也可感染哺乳动物和人。在混合感染病例中，除烟曲霉外，亦可见黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、青霉菌及毛霉菌。本菌引起的霉菌病,世界各国均有报道。

本菌在感染组织的过程中，还产生一种蛋白质毒素，可导致动物组织发生痉挛、麻痹，直至死亡。

毒素的提取物对家兔 、豚鼠、小鼠和鸡有毒性，兔和犬尤为敏感，但鸽却有抵抗力，而鹤对本菌感染十分敏感。

微生物检验

w 迸行微生物学检查时要采取病料，如肺部结节、鼻分泌物、痰液或病损处刮取物，进行切片或压片，镜检，在高倍镜下观察，可见分隔菌丝、分生孢子梗及孢子等结构。

w 必要时进行分离培养，有鉴别意义的主要特征是：顶囊由分生孢子梗逐渐膨大而形成，状如烧瓶，小梗着生于顶囊的上半部，小梗单层，小梗和分生孢子链按与分生孢子梗平行的方向升起，菌落呈暗绿色至黑褐色。

2、黄曲霉（A. flavus）

菌落：黄色

顶囊：球形或近球形

小梗：双层，第一层长，布满顶囊表面，放射状

孢子：球形或梨形，有小棘，成链排列

黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称AFT或AF)

w 黄曲霉菌中有30%~60%的菌株产生毒素，而寄生曲霉菌几乎都能产生黄曲霉毒素。

w 该毒素常见于霉变的花生、玉米等谷物，在鱼粉、肉制品、咸干鱼、奶和肝脏中也可发现。

w 黄曲霉毒素对多种动物呈现毒性作用，但不同动物的敏感性不同，鸭、兔、猫、猪、犬较敏感，猴、豚鼠、小鼠、羊敏感性较低。

w 根据黄曲霉毒素的毒性作用，可将中毒分为三类，即急性或亚急性、慢性、致癌性。

毒素检验

w 在各种黄曲霉毒素中，B1的毒性和致癌性最强，其次是G1。

w 黄曲霉污染物中，最常见的是黄曲霉毒素Bl，其含量最高。Ml是B1的代谢产物，用含黄曲霉毒素B1的饲料喂牛，奶牛可分泌M1入牛奶，危害人类健康。

w 美国食品药品管理局(FDA)对牛奶中的Ml检测含量控制<0.5mg/kg，而欧盟则为< 0.05mg/kg。

w 毒素检测 从可疑饲料提取毒素，饲喂l日龄鸭，可见肝坏死、出血及胆管上皮增生等。

3、杂色曲霉（ A. versicolor）

w 分生孢子头 呈粗糙的半球形、放射状,

w 分生孢子梗 无色或微黄、壁厚、光滑

w 顶囊 半椭圆形至半球形，顶囊生有双层小梗。

w 分生孢子 为球形、有小刺，呈链状

杂色曲霉素

w 由杂色曲霉产生，是化学结构相似的一类毒素，其中杂色曲霉素Ⅳa为重要的一种，呈淡黄色针状结晶。

w 杂色曲霉素具有急性、慢性毒性及致癌性，主要损害肝、肾。

微生物检验

(1)直接显微镜检查

w 取痰液等被检材料涂于载玻片上，在镜下可见分枝的菌丝、较粗的分生孢子头，顶端膨大形成顶囊，顶囊上有小梗，小梗上有许多小分生孢子。

(2)抗原检测 用竞争性ELISA测定病人血清中曲霉抗原。

(3)分离培养与鉴定 标本接种沙氏琼脂，室温培养后菌落形成快，呈毛状，一般为黄绿色。将菌落涂片镜检可见特征性的分子孢子头和足细胞。

(4)药物敏感试验 对制霉菌素和两性霉素B敏感。

(5)抗体检测 检测病人血清中抗曲霉抗体。常用免疫扩散检测，其敏感性和特异性较高，也可用对流免疫电泳、ELISA、生物素-亲和素联免疫吸附测定(BALISA)、放射免疫测定(RIA)及间接免疫荧光法等。菌丝和培养滤液可作ELISA抗原。

(6)皮肤试验 对过敏性支气管肺炎病人可

用曲霉抗原提取液作皮试。

Ⅰ型超敏反应在 15-20min发生阳性反应。

Ⅱ型超敏反应在4-10h出现阳性反应。

Ⅳ型超敏反应可出现于超敏反应型肺炎病人。