妙啊！一石二鸟！利用碱基编辑共编辑策略

Generation of transgene-free homozygous early-flowering poplar via cytosine base editing”，该研究利用胞嘧啶碱基编辑器，通过共编辑一个内源筛选标记基因和一个目标农艺性状基因，高效地在T0代获得无转基因的纯合突变体，并成功培育出早花杨树。

该研究的策略核心是“一石二鸟”的共编辑（co – editing）思路：

第一“鸟”（筛选标记）：选择杨树内源的乙酰乳酸合成酶基因（PdbALS1和PdbALS2）作为编辑靶点。通过CBE在该基因的保守位点（Pro177）引入C – to – T突变，可以使其编码的蛋白对除草剂氯磺隆产生抗性。这样，ALS基因自身就成为了一个高效的内源筛选标记，成功编辑的细胞/植株能在含氯磺隆的培养基上存活，从而无需引入外源抗性基因。

第二“鸟”（目标性状）：同时编辑控制开花时间的关键基因CENTRORADIOLIS1(CEN1)。已知该基因的功能缺失突变能够诱导杨树提早开花，这是一个对加速育种进程极为有利的性状。

通过这一策略，研究者可以在氯磺隆培养基上直接筛选出ALS基因被成功编辑的转化体，并从这些群体中进一步鉴定同时带有CEN1基因突变且不含T – DNA元件的无转基因、纯合、优良性状的植株。

研究团队首先仅针对PdbALS基因进行了编辑验证。他们构建了靶向PdbALS1和PdbALS2位点的CBE载体，并转化“山新杨”。在含有15 μg/L氯磺隆的培养基上成功筛选出抗性株系。

在随机挑选的10个抗性株系中，通过PCR检测发现，高达40%（4个株系）的植株已经不含有Cas9和sgRNA等外源T – DNA片段（图1B），证明了该策略在T0代直接获得无转基因植株的可行性。

测序结果显示，所有抗性株系都至少含有一个发生了赋予抗性突变（P177L 或 P177S）的PdbALS等位基因。其中，70%的株系中两个PdbALS基因均被编辑，部分株系甚至产生了纯合的无义突变（图1C, 1D）。这些结果表明，仅用CBE就能高效地在杨树中实现多位点的同时编辑。

在验证了该策略的可行性后，研究团队将ALS和CEN1的sgRNA置于同一载体中进行共编辑转化。针对PdbCEN1及其旁系同源基因PdbCEN2的第一个外显子设计sgRNA，在第5个胞嘧啶处引入C – to – T突变，产生移码突变导致的提前终止密码子（图2A）。

在获得的45个氯磺隆抗性植株中，测序鉴定出15个（33.3%）在PdbCEN1或PdbCEN2上发生了目标编辑。其中，L5 – ALS/CEN 和 L8 – ALS/CEN 等株系分别在PdbCEN1或两个CEN基因上均实现了纯合突变（图2B）。PCR及后续的全基因组测序分析证实，在15个PdbCEN编辑株系中，有4个（包括纯合突变体L5 – ALS/CEN）是无转基因的（图2C, 2D, 2E）。

表型观察发现，pdbcen1纯合突变体（L5 – ALS/CEN）和pdbcen1 pdbcen2纯合突变体（L8 – ALS/CEN）在生根培养基上生长一个月后，均表现出显著的早花表型，在叶腋和茎尖处形成了多样的花结构（图2F, 2G, 2J）。移栽入土壤后，新萌发的侧枝依然保持了早花性状（图2K）。

本研究为木本植物的遗传改良提供了一个极具价值的技术范例。其验证了CBE共编辑策略在杨树基因编辑的高效性，并成功实现了T0代无转基因纯合体的创制。这项工作不仅为杨树的遗传改良提供了强有力的工具，也为其他童期漫长、依赖无性繁殖的经济植物（如果树、花卉等）的精准育种开辟了新的思路。