MST 微量热泳动技术：2024年上半年部分高分文章分享

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MST (Microscale Thermophoresis) 微量热泳动技术，是一种定量分析生物分子间相互作用的前沿技术。通过检测在温度梯度场中荧光标记生物分子泳动速率的差异，定量分析分子间相互作用的亲和力。实验时对互作分子中的一个分子进行荧光标记，使之成为非常灵敏的标签分子，在 MST 技术中称之为 Target；与之互作的另一个分子称之为 Ligand。

Target 分子与 Ligand 分子结合形成复合物，复合物分子的尺寸、水化层和电荷的改变都可以导致其热泳动速度相对于 Target 分子发生改变，因此很容易检测到由 Target 与 Ligand 分子的结合引起的 MST 信号变化。

进行 MST 实验时将 Ligand 分子按照 2 倍的浓度梯度稀释配制 16 管溶液，然后和 Target 分子等体积混合，吸入毛细管后放入仪器中进行检测。检测时仪器中的红外激光束对毛细管的检测区域正中心进行加热，激光束周围的溶液形成温度梯度，分子在温度梯度溶液中由高温区域向低温区域定向移动，移动速度和分子的尺寸大小、水化层及电荷有关。激发光激发 Target 分子上的荧光基团，通过检测 Target 分子荧光基团发出的发射光的荧光强度变化，从而记录了热泳动速度的差异 (图1)。

图1 微量热泳动技术 (MST) 工作原理

案例一 MST 在蛋白质与核酸互作中的应用

2024年，清华大学生命学院刘俊杰 (Jun-Jie Gogo Liu) 课题组联合北京大学生命学院白洋课题组和清华大学生命学院陈春来课题组在 Nature 杂志在线发表了题为“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity” 的研究论文。文章研究揭示了 II-C 型 Cas9 蛋白在结构水平上的多样性和进化轨迹，并识别了许多 NAGs，如 PcrIIC1，它作为促进 CRISPR 因子增强了 CRISPR 介导的免疫力[1]。

研究人员前期通过鉴定大量基因及蛋白预测工作，揭示了 II-C 型 Cas9 的三个结构生长轨迹，进而发现了 Chrysobacterium 物种的 CbCas9 会与 CRISPR–Cas 系统促进 (pro-CRISPR) 蛋白 (PcrIIC1) 形成异源四聚体复合物。验证 PcrIIC1 能够作为一种 CRISPR 免疫增效子。

后续研究人员采用 MST 技术验证 PcrIIC1 和 apo-CbCas9 之间的亲和力，首先用 25 nM Red-tris-NTA 标记 CbCas9，随后将分析物 PcrIIC1 进行梯度稀释(0.00305 μM–100 μM)，测得 PcrIIC1 与 CbCas9 具有中等的结合亲和力 (Kd=2.56±0.28 μM) (图2a)。

但值得注意的是，当将 CbCas9 与 sgRNA 室温下共孵育形成 CbCas9–sgRNA RNP 后，再与 dsDNA targets 共孵育形成 CbCas9–sgRNA–dsDNA ternary 复合物，测定 PcrIIC1和 CbCas9–sgRNA 之间的结合亲和力增加到 334±120 nM的 Kd 值，而与 PcrIIC1 和 Cb Cas9–sgRNA–dsDNA 之间的结合亲和性增加到 275±86 nM (28 bp) (图2b，c)，这表明 sgRNA 表达可能作为天然宿主中异源四聚体组装的检查点[1]。

图2 MST 技术测定 CbCas9 和 PcrIIC1 结合的三个阶段

此外，与单独的 CbCas9 相比， CbCas9-PcrIC1 复合物表现出增强的 DNA 结合 (图3) 进而体现出切割活性，对原间隔区相邻基序序列的兼容性更广，对错配的耐受性更强，抗噬菌体免疫性增强。

图3 PcrIIC1 增强 CbCas9 的 DNA 结合

以上结果说明CbCas9-PcrIIC1复合体的形成对整个CRISPR-Cas系统的免疫增强至关重要。

MST

MST experiments were performed using a Monolith NT115pico Series instrument (NanoTemper technologies). N-terminal 10×His-tagged dCbCas9 was diluted to 50 nM in MST buffer (20 mM HEPES-Na pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT and 0.05% Tween20) and labelled using the RED-tris-NTA 2nd generation dye (NanoTemper technologies) following the manufacturer’s instructions. To assess the binding affinity between PcrIIC1 and apo-CbCas9, 25 nM CbCas9 protein was incubated with a dilution series of PcrIIC1 (0.00305 μM–100 μM) for MST. To determine the binding affinity between PcrIIC1 and CbCas9– sgRNA or CbCas9–sgRNA–dsDNA complexes, 5 μM CbCas9 protein was incubated with 6 μM sgRNA at 25 °C for 45 min in MST buffer to form a CbCas9–sgRNA RNP complex. dsDNA targets (7.5 μM) were further added and incubated with the RNP complex at 25 °C for 30 min to form the CbCas9–sgRNA–dsDNA ternary complex. All complexes were diluted to 50 nM in MST buffer and labelled using the RED-tris-NTA 2nd generation dye. Different complexes (25 nM) were incubated with a dilution series of PcrIIC1 (0.00381 μM–62.5 μM) for MST. All MST assays were performed at 25 °C using premium capillaries (NanoTemper) at 40% LED excitation and medium MST power. Data were further analysed and visualized using the NanoTemper MO. affinity analysis software package.

案例二 MST 在激素与蛋白互作中的应用

清华大学生命科学学院王一国副教授和南方医科大学南方医学院张惠杰教授在国际知名期刊 Cell 上发表了 “A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism” 的论文，该研究首次发现并命名了一种肠道激素—— Cholesin (肠抑脂素)，并揭示了 Cholesin 在调控机体胆固醇稳态方面的作用和调控机制。Cholesin-GPR146 信号轴介导了肠道胆固醇吸收和对肝脏胆固醇合成的抑制作用，这种新发现的激素胆固醇素有望成为防治高胆固醇血症和动脉粥样硬化的有效药物[2]。

为了研究 GPR146 是否是 Cholesin 的受体，研究人员采用了 MST 技术证实 Cholesin 与 GPR146 的结合具有很高的亲和力。根据 GPR146 的保守性和预测结构，研究团队通过将 6 个氨基酸与丙氨酸重置生成了GPR146的突变体。与 WTGPR 146 相比，突变体 GPR146 对 Cholesin 的亲和力明显降低，并且无法恢复 GPR146—/—原代肝细胞与 Cholesin 的结合 (图4)。体外结合实验证明 Cholesin 是GPR146 的直接作用受体[2]。

图4 微量热泳动技术 (MST) 定量测定肠抑脂素 -His 与 GPR146 (野生型或突变体)的结合亲和力[2]

案例三 MST 在膜蛋白互作研究中的应用

2024年，上海科技大学张璐研究员/饶子和院士团队在 Nature Microbiology 发表题为“Structural analysis of phosphoribosyltransferase-mediated cell wall precursor synthesis in Mycobacterium tuberculosis”的研究，解析结核分枝杆菌全新药物靶标——膜蛋白磷酸核糖转移酶 Rv3806c 与其受体底物 DP 和供体底物 PRPP 结合复合物的精细三维结构，为研究 Rv3806c 作为新靶点的靶向性药物研发提供了重要的理论基础。

研究人员通过对 Rv3806c 与供体底物 PRPP 复合物结构分析，推测可能影响 Rv3806c 结合和酶活的位点，并通过 MST 技术测定 PRPP 与野生型 WT-Rv3806c 及突变体的亲和力，结果证明：核糖基团对于 PRPP 与 Rv3806c 的结合至关重要 (图5a)。此外，体外 PRTase 酶活实验结果发现：实验显示 PRPP 焦磷酸上的β-磷酸和末端5′-磷酸在 Rv3806c 活性中起关键作用 (图5b)。

图5 MST 测定 PRPP 与 WT-Rv3806c 及突变体的结合亲和力

此外，研究发现，供体底物 PRPP 通过一个 Mg2+ 结合在 TM 螺旋束-1的空腔。为了研究 Mg2+ 对 Rv3806c 结合供体底物 PRPP 的作用，作者使用 MST 技术和 DSF 技术检测存在或不存在 Mg2+ 时，Rv3806c 与底物 PRPP 的结合 (图6)。实验结果显示：加入 Mg2+ 后，PRPP 与 Rv3806c 的亲和力提高了近 20 倍，说明，Mg2+ 对 PRPP 与 Rv3806c 的结合至关重要。

图6 MST和DSF分析在 Mg2+ 存在或不存在的情况下，PRPP 与 Rv3806c 的结合亲和力

MST assay

The MST assay was performed as described64. The binding affinities of GDN-purified WT-Rv3806c or mutants were measured using a Monolith NT.115 (Nanotemper Technologies). The His-tagged protein was labelled with RED fluorescent dye NT-647 according to the manufacturer’s procedure. For each assay, the labelled protein at 200 nM was incubated with the same volume of unlabelled ligands at 16 different concentrations in the Buffer C at room temperature for 5 min. Assays of all the mutants were added with 2.5 mM MgCl2. The samples were then loaded into capillaries (NanoTemper Technologies) and measured at 25 °C by using 40% Light Emitting Diodes and medium MST power. Binding affinities of PRPP with the WT-Rv3806c and mutants were measured under the same parameter. Each assay was repeated three to five times. Kd values were calculated using the MO. Affinity Analysis v.2.2.4 software. All the final plots were made using GraphPad Prism 9.0.

Trp fluorescence measurements (NanoDSF assay)

Four micromolar GDN-purified Rv3806c protein was incubated with or without MgCl2/PRPP/ethylenediaminetetraacetic acid. Samples were measured by Prometheus NT.48 (NanoTemper) using Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries through 15% excitation light. Samples were measured in temperature range 20–95 °C with temperature slope of 1 °C min−1 (ref. 65). The final plots were made using GraphPad Prism 9.0.

参考文献

[1] Zhang, Shouyue, et al. “Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity.” Nature (2024): 1-9.

[2] Hu, aoli, et al. “A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism.” Cell 187.7 (2024): 1685-1700.

[3] Gao, Shan, et al. “Structural analysis of phosphoribosyltransferase-mediated cell wall precursor synthesis in Mycobacterium tuberculosis.” Nature Microbiology 9.4 (2024): 976-987.